研究背景先天性心臟病(Congenital heart disease,CHD)是最常見的出生缺陷之一,包括一系列的心血管畸形。目前認(rèn)為是CHD患者的遺傳因素和其相關(guān)的環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。心臟發(fā)育是一個精細(xì)的過程,與心臟發(fā)育相關(guān)的基因表達(dá)都受到精細(xì)的調(diào)控。除了基因序列的變異可以導(dǎo)致基因表達(dá)水平改變外,環(huán)境因素通過表觀遺傳學(xué)機制在基因表達(dá)調(diào)控方面的重要作用受到越來越多的重視。表觀遺傳學(xué)(Epigenetics)機制包括甲基化修飾、微小RNA調(diào)控及組蛋白修飾等。其中甲基化修飾是目前研究最多的表觀遺傳學(xué)現(xiàn)象。DNA甲基化是最常見的基因表觀修飾方式之一。它主要是指通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶將S-腺苷甲硫氨酸的甲基轉(zhuǎn)移到DNA胞嘧啶的5'位,形成5-甲基胞嘧啶。這種DNA修飾方式并沒有改變基因的序列,但是它可以調(diào)控基因的表達(dá)、維護(hù)染色體的完整性、調(diào)節(jié)DNA重組及某些基因的轉(zhuǎn)錄活性。啟動子是位于結(jié)構(gòu)基因5'端上游的DNA序列,能活化RNA聚合酶,使之與模板DNA準(zhǔn)確的結(jié)合并控制基因轉(zhuǎn)錄的起始和表達(dá)程度。啟動子對基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控主要表現(xiàn)為順式作用元件、反式作用因子及RNA聚合酶三者之間的相互協(xié)同作用,其本質(zhì)為DNA與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用。啟動子區(qū)序列的變異可以通過影響轉(zhuǎn)錄因子等反式作用因子與順式作用元件的結(jié)合而導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄水平的變化。除了序列的變化,越來越多的研究表明基因啟動子區(qū)DNA甲基化水平的改變能夠調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄水平。啟動子區(qū)CpG島甲基化增高將影響基因的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而抑制基因的表達(dá)及功能,而去甲基化則誘導(dǎo)基因的重新活化和表達(dá)。甲基化和去甲基化主要通過直接和間接兩種機制控制基因的表達(dá)。直接機制是指CpG島甲基化直接通過抑制RNA聚合酶活性或干擾某些轉(zhuǎn)錄因子與基因調(diào)控區(qū)的結(jié)合而抑制基因的表達(dá)。間接機制主要包括兩種類型:1.基因啟動子調(diào)控序列甲基化后與甲基化CpG結(jié)合蛋白結(jié)合,阻止該基因與其它轉(zhuǎn)錄因子形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物;2.基因啟動子區(qū)DNA甲基化后通過改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)而阻礙基因DNA與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合。以往的研究表明,轉(zhuǎn)錄因子、信號分子、細(xì)胞粘附分子及離子通道分子是參與心臟發(fā)育的最主要有四類分子。其中,目前研究最多的是轉(zhuǎn)錄因子,包括鋅指家族、同源結(jié)構(gòu)域家族、T-box(TBX)家族、基本螺旋-環(huán)-螺旋和MADS區(qū)域家族等。轉(zhuǎn)錄因子是指能與核酸特異性序列相結(jié)合的蛋白質(zhì),通過識別和結(jié)合基因啟動子區(qū)域的順式作用元件從而調(diào)控基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄因子作用于下游基因的同時也同時受上游誘導(dǎo)信號的調(diào)節(jié),它們構(gòu)成一個復(fù)雜而精確的網(wǎng)絡(luò)對心臟的發(fā)育起重要的調(diào)節(jié)作用。T-box家族屬發(fā)育調(diào)控相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子家族,通過其特有的T-BOX區(qū)域參與多種生物的發(fā)育調(diào)控。T-box家族均具有一個大的DNA結(jié)合域T-BOX,與其結(jié)合的所有DNA序列都存在一致性序列TCACACCT即T半位點,因此編碼該蛋白的基因稱為T-box基因。T-box基因家族分為5個不同的亞家族,其中主要與心臟發(fā)育相關(guān)的有TBX1亞家族的TBX1、TBX18、TBX20及TBX2亞家族的TBX2、TBX3和TBX5。它們通過協(xié)同和競爭機制在心臟的發(fā)育過程中起著重要的作用。法洛四聯(lián)癥(tetralogy of Fallot,TOF)是最常見的紫甜型先心病,約占先天性心臟病的10%,是胚胎時期圓錐動脈干發(fā)育異常所致,肺動脈狹窄、室間隔缺損、主動脈騎跨和右心室肥厚是其主要的病理特征。法洛四聯(lián)癥患兒自然預(yù)后不佳,若未及時診治大多在成年期前死于慢性缺氧導(dǎo)致的繼發(fā)性心肌肥大和心力衰竭。即使手術(shù)糾治仍有少部分患兒因術(shù)后心律失常等并發(fā)癥而發(fā)生猝死。法洛四聯(lián)癥作為臨床最常見的圓錐動脈干畸形,部分患者存在染色體及基因的突變,但目前還沒有明確致病基因的報道。目前認(rèn)為與法洛四聯(lián)癥相關(guān)的基因有NKX2.5、TBX20、CX43、TBX1、GATA4、FOG2、TBX5、HIRA、RXAa、TGFβ 2、PAX3、VANGL2 等。TBX20的全稱為T-box20,定位于7號染色體的短臂14區(qū)2帶,屬于轉(zhuǎn)錄因子TBX家族的TBX1亞家族。通過對小鼠胚胎的研究顯示TBX20在心臟成環(huán)早期的心內(nèi)膜墊有很強的表達(dá),在后期的流出道、房室管及房間隔中隔前緣等心內(nèi)膜墊結(jié)構(gòu)的表達(dá)更加顯著。目前TBX20是T-box家族發(fā)現(xiàn)的唯一可以在心內(nèi)膜墊穩(wěn)定和廣泛表達(dá)的成員。而心內(nèi)膜墊的異常發(fā)育可以導(dǎo)致多種先天性心臟病的發(fā)生,包括大動脈轉(zhuǎn)位、右室雙出道、法洛四聯(lián)癥、房室間隔缺損等。因此,TBX20基因是人類圓錐動脈干畸形候選基因之一。TBX2基因定位于染色體17q23,它在胚胎發(fā)育的各種組織和器官中廣泛表達(dá)。TBX2異常表達(dá)小鼠常伴有流出道間隔缺損及心腔特異性基因的異常表達(dá)。以往的研究表明,TBX20可以促進(jìn)心腔心肌特異性基因的表達(dá)而抑制TBX2的表達(dá),對心腔心肌的增殖和分化起著至關(guān)重要的研究。Cai等認(rèn)為BMP2是TBX20在房室管發(fā)育中的關(guān)鍵下游基因之一,他們認(rèn)為TBX20不僅直接抑制TBX2的表達(dá),而且通過BMP2信號通路間接促進(jìn)了 TBX2的表達(dá)。先前的研究表明TBX20突變僅發(fā)生于少部分先天性心臟病患兒中,TBX20序列的改變并不能完全解釋它在先天性心臟病中的致病作用。目前,對人類相關(guān)基因的甲基化研究主要集中在腫瘤組織中,而DNA甲基化在先天性心臟病中的致病作用研究甚少。研究目的1.檢測法洛四聯(lián)癥患兒右室流出道心肌組織TBX20基因啟動子區(qū)甲基化水平及TBX20基因mRNA及蛋白的表達(dá)。探討TBX20基因啟動子甲基化水平與TBX20基因表達(dá)的關(guān)系。2.檢測TBX20基因相關(guān)因子TBX2及BMP2在法洛四聯(lián)癥患兒心肌組織的mRNA及蛋白表達(dá)。探討TBX20與TBX2和BMP2之間的關(guān)系,并揭示它們在法洛四聯(lián)癥中的致病作用。3.探討TBX20基因啟動子區(qū)甲基化在法洛四聯(lián)癥的致病作用,為研究TBX20基因在法洛四聯(lián)癥的致病機制提出新的研究模式,進(jìn)一步為先天性心臟病圍產(chǎn)期篩查提供理論依據(jù)。研究方法1.利用NCBI網(wǎng)站查找TBX20啟動子轉(zhuǎn)錄起始點上游2000 bp及下游1000 bp的序列。采用Methyl Primer Express Software vl.0查找TBX20基因啟動子區(qū)CpG 島分布情況。利用 Neural Network Promoter Prediction 查看 TBX20 基因核心啟動子序列。利用JASPAR軟件預(yù)測TBX20基因CpG島區(qū)與其它轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點。2.選取23例法洛四聯(lián)癥患兒及5例意外死亡兒童的心臟右室流出道心肌組織為研究對象。采用重亞硫酸鹽PCR測序方法檢測TBX20基因啟動子區(qū)的甲基化水平。采用熒光定量PCR檢測TBX20基因及其相關(guān)因子TBX2、BMP2的mRNA表達(dá)。通過蛋白質(zhì)印跡實驗檢測TBX20基因及其相關(guān)因子TBX2、BMP2的蛋白表達(dá)。3.統(tǒng)計分析:采用SPSS 22.0及GraphPad prism v5軟件分析數(shù)據(jù)。正態(tài)分布數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,非正態(tài)分布數(shù)據(jù)以中位數(shù)及四分位數(shù)表示。TBX20基因啟動子區(qū)甲基化水平、mRNA及蛋白相對表達(dá)的正態(tài)數(shù)據(jù)采用t檢驗,非正態(tài)數(shù)據(jù)采用Mann-Whitney檢驗。采用Spearman檢驗TBX20與mRNA是否具有相關(guān)性,P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果1.利用生物信息學(xué)網(wǎng)站及軟件分析TBX20基因啟動子(-400bp～-48bp)位于CpG島內(nèi)。該區(qū)域共含42個CpG位點,預(yù)測該區(qū)域含有多個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(TFAP2、GATA5 及 TBX1/2/4/5 等)。2.法洛四聯(lián)癥組TBX20基因啟動子區(qū)(-400bp～-48bp)總體甲基化水平較對照組降低(P=0.035)。在42個CpG位點中,法洛四聯(lián)癥組第26 CpG位點甲基化水平較對照組降低(P=0.016)。其余位點兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。3.法洛四聯(lián)癥組右室流出道心肌組織TBX20基因mRNA表達(dá)較對照組明顯增高(P0.001),差異有統(tǒng)計學(xué)意義。法洛四聯(lián)癥組右室流出道心肌組織TBX20啟動子區(qū)(-400bp～-48bp)甲基化水平與其mRNA表達(dá)水平成負(fù)相關(guān),r=0.81,P0.001。法洛四聯(lián)癥組右室流出道心肌組織TBX20蛋白表達(dá)較對照組增高(P=0.008),差異有統(tǒng)計學(xué)意義。4.法洛四聯(lián)癥組右室流出道心肌組織TBX2基因mRNA表達(dá)低于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.001)。法洛四聯(lián)癥組右室流出道心肌組織BMP2基因mRNA表達(dá)與對照組相比無明顯差異(P=0.082)。5.TBX2蛋白在法洛四聯(lián)癥組右室流出道心肌組織的表達(dá)低于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.022)。法洛四聯(lián)癥組右室流出道心肌組織BMP2蛋白的表達(dá)與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.537)。結(jié)論1.TBX20基因啟動子區(qū)(-400bp～-48bp)含有多個轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件,該區(qū)域甲基化的降低可能影響了 TBX20基因啟動子與TFAP2C的結(jié)合進(jìn)而造成TBX20基因mRNA及蛋白表達(dá)增高。2.TBX20基因表達(dá)增高可以抑制TBX2基因mRNA及蛋白的表達(dá)。TBX20及TBX2基因的表達(dá)異常均可以導(dǎo)致心臟的發(fā)育異常,這可能是法洛四聯(lián)癥的致病機制之。3.TBX20基因啟動子區(qū)的甲基化水平異常可能在法洛四聯(lián)癥發(fā)病中起重要作用。本研究為進(jìn)一步探索TBX20基因在法洛四聯(lián)癥中的致病機制提出了新的研究模式,同時為先天性心臟病的圍產(chǎn)期篩查提供了新的理論依據(jù)。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R725.4
【部分圖文】：
圖１－１?ＴＢＸ２０基因啟動子（＿４００ｂｐ？＿４８ｂｐ）生物信息學(xué)分析：該區(qū)域共含４２??個ＣｐＧ位點，利用ＪＡＳＰＡＲ軟件預(yù)測該區(qū)域含多個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。??
?ＴＦＡＰ２Ａ、２Ｂ、２Ｃ??ＣＴＣＡＧＣＣＴＧＧＧ??圖１－１?ＴＢＸ２０基因啟動子（＿４００ｂｐ？＿４８ｂｐ）生物信息學(xué)分析：該區(qū)域共含４２??個ＣｐＧ位點，利用ＪＡＳＰＡＲ軟件預(yù)測該區(qū)域含多個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。??４０??
?ＴＯＦ?Ｃｏｎｔｒｏｌ??圖１－３?４：右室流出道心肌組織了８義２０基因啟動子區(qū)（－４０（＾口？－４８匕口）總體甲基??化水平分析，釆用Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ檢驗，右室流出道心肌組織ＴＢＸ２０??基因啟動子區(qū)（＿４００ｂｐ？－４８ｂｐ）第２６?ＣｐＧ位點甲基化水平比較。釆用??Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ?檢驗，０５〇??４２??
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本文編號：
2889943
