發(fā)布時間：2020-11-17 20:13

　　 野燕麥?zhǔn)且环N世界性惡性農(nóng)田雜草,主要以化學(xué)防治為主,由于除草劑大量單一使用,已經(jīng)產(chǎn)生嚴(yán)重的抗性。為了明確野燕麥對除草劑的抗性及其機理,本文采用整株測定法測定了24個野燕麥種群對精噁唑禾草靈的敏感度以及離體條件下測定其乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)對精噁唑禾草靈的敏感度,并進一步探討了野燕麥相對抗性種群和敏感種群ACCase基因相對表達量差異以及ACCase氨基酸序列突變點檢測。具體結(jié)果如下:1、通過整株測定法測定了24個野燕麥種群對精噁唑禾草靈的敏感度。結(jié)果表明,就莖而言,對精噁唑禾草靈最不敏感的野燕麥種群是西華(周口),其IC_(50)的值為643.790g.a.i/hm~2,襄縣(許昌)是最敏感的種群,其IC_(50)值為4.23 g.a.i/hm~2,兩者相差151.2倍;就根而言,武陟(焦作)是最不敏感的地區(qū),其IC_(50)為2977.041 g.a.i/hm~2,鄢陵(許昌)是最敏感的地區(qū),其IC_(50)為793.75 g.a.i/hm~2,兩者相差2.75倍。雖然根與莖對精噁唑禾草靈的敏感度差異性很大,但均表明,野燕麥對精噁唑禾草靈產(chǎn)生了不同程度的抗性。2、離體條件下測定了24個野燕麥種群ACCase對精噁唑禾草靈的敏感度。結(jié)果表明,鶴山(鶴壁)地區(qū)的野燕麥種群ACCase對精噁唑禾草靈的敏感度最高,其IC_(50)為11.334 mg/L;社旗(南陽)地區(qū)野燕麥種群ACCase對精噁唑禾草靈的敏感度最低,其IC_(50)為17720.677mg/L。綜合不同種群野燕麥對精噁唑禾草靈的敏感度來看,對精噁唑禾草靈敏感度低的野燕麥種群,其ACCase對精噁唑禾草靈的敏感度也都較低,反之亦然。這說明野燕麥對精噁唑禾草靈的抗性與ACCase關(guān)系密切。3、用IC_(10)(6.9 mg/L)的精噁唑禾草靈處理24小時后,采集樣本并構(gòu)建cDNA文庫,然后通過轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-Seq)篩選出差異表達的ACCase基因,最后利用實時熒光定量PCR對其中相似度最高的ACCase基因進行驗證。結(jié)果共篩選出8個注釋為乙酰輔酶A羧化酶的unigenes,其中有5個下調(diào),3個上調(diào)。為了進一步明確ACCase與野燕麥對精噁唑禾草靈抗藥性之間的關(guān)系。我們用精噁唑禾草靈分別處理社旗(Y21),西華(Y3),召陵(Y24)三個抗性種群和敏感種群鶴山(Y11),24 h后收集樣本,通過熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)分析精噁唑禾草靈對其ACCase基因表達的影響。結(jié)果表明,3個抗性種群與一個敏感種群的ACCase基因的相對表達量均受到了精噁唑禾草靈的抑制,但抗性種群受到的抑制程度明顯要小于敏感種群。這表明野燕麥對精噁唑禾草靈的抗性與ACCase基因的表達能力有關(guān)。將3個抗性種群ACCase基因相對表達量進行比較,我們發(fā)現(xiàn)ACCase基因相對表達量由高到低依次為社旗(Y21),西華(Y3),召陵(Y24),與ACCase對精噁唑禾草靈敏感度測定結(jié)果一致。4、為了驗證野燕麥對精噁唑禾草靈的抗性是否由ACCase基因突變引起。我們將遂平(Y19),社旗(Y21),西華(Y3),召陵(Y24)4個相對抗性種群和鶴山(Y11),溫縣(Y7),舞陽(Y9),淮陽(Y16)4個相對敏感種群的ACCase基因進行克隆,然后與大穗看麥娘(Alopecurus myosuroides,GeneBank accession No.AJ310767)ACCase全長基因進行多序列比對。結(jié)果表明,所測地區(qū)野燕麥種群在已報道的ACCase氨基酸序列突變(Ile-1781-Leu,Trp-1999-Cys,Trp-2027-Cys,Ile-2041-Asn,Asp-2078-Gly,Cys-2088-Arg)處均沒有發(fā)生點突變。這表明我們所測定的野燕種群對精噁唑禾草靈的抗藥性不是由所報道的靶標(biāo)位點突變引起的。
【學(xué)位單位】：河南科技學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S451
【部分圖文】：

BCCP）亞基，生物素羧化酶（biotin carboxylase，BC）亞基和轉(zhuǎn)羧酶（biotintranscarboxylase，CT）的α亞基（CTα）與β亞基 （CTβ）這四個亞基組成。BCCP 亞基和 BC 亞基為同型二聚體，CTα 和 CTβ為異型二聚體，兩者以共價鍵相連，形成 CT 催化域。以上四個亞基結(jié)合在一起形成 ACCase 全酶，可能以（BC）2（BCCP）4（CTα, CTβ）2的形式存在[7]，但異質(zhì)型的 ACCase 并不穩(wěn)定，容易解離。同質(zhì)型的 ACCase 為真核類型 ACCase[8]，它的一條多肽鏈含有異質(zhì)型 ACCase 所有 4 個亞基，這四個亞基按照 BC、BCCP、CTβ、CTα的順序排列，形成了 BC，BCCP 和 CT 三個功能域（CTβ 和 CTα 算一個功能域）（如圖 1-1）[9-11]。相對于異質(zhì)性 ACCase，在活性狀態(tài)下的同質(zhì)型 ACCase呈現(xiàn)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易解離的同型二聚體。所有生物體內(nèi)同質(zhì)型 ACCase 都具有相同的組織結(jié)構(gòu)：NH2-BC-BCCP-CT-COOH。此外這兩種 ACCase（ACCaseⅠ和 ACCaseⅡ）還存在兩個特殊情況：第一就是在禾本科植物中，無論是質(zhì)體還是胞質(zhì)溶膠，它們的ACCase 類型都是同質(zhì)型（如圖 1-2）[12]；第二是油菜的葉綠體有可能同時含有 ACCaseⅠ和 ACCaseⅡ。

第一章 緒論類 ACCase 僅由α和β兩個亞基組成，其中α亞基包含 BC 和 BCCP 兩個功能域，β亞基包含 CT 功能域。第四類 ACCase 是在古細(xì)菌（Melallosphaera .sedula）研究中發(fā)現(xiàn)的，該類 ACCase 的結(jié)構(gòu)與異質(zhì)型 ACCase 較為相似，唯一不同的地方為 CT 功能域只由一個亞基組成[7]。

圖 1-2 植物體內(nèi)乙酰輔酶 A 羧化酶類型Fig 1-2 Structures of plant ACCase1.1.2 植物體內(nèi)乙酰輔酶 A 羧化酶羧化酶的功能兩種 ACCase 在植物體內(nèi)脂肪酸合成中發(fā)揮的作用各不相同（如圖 1-3），ACCaseⅡ首先是通過其 BC 域的催化和 ATP 的參與下發(fā)生羧化作用，使與蛋白結(jié)合的生物素輔基羧化，然后再在 CT 域的催化作用下將羧基從生物素轉(zhuǎn)移到乙酰輔酶 A 羧化酶上，形成丙二酰輔酶 A，此丙二酰輔酶 A 用于脂肪酸的從頭合成。ACCaseⅠ催化生成的丙二酰輔酶 A 則用于延伸脂肪酸鏈及合成與類黃酮有關(guān)的次生代謝產(chǎn)物[15-16]
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本文編號：2887868