發(fā)布時(shí)間：2018-10-31 11:05

【摘要】：目的通過(guò)建立模擬人唇裂術(shù)后傷口愈合的兔上唇瘢痕模型,對(duì)此模型進(jìn)行術(shù)后瘢痕生長(zhǎng)的時(shí)間序列研究以明確兔上唇唇裂術(shù)后瘢痕增生最嚴(yán)重程度所在時(shí)間。通過(guò)構(gòu)建p38MAPK基因沉默重組腺病毒干擾靶基因的表達(dá),檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)p38MAPK信號(hào)通路受阻后對(duì)兔模型上唇瘢痕的影響效果來(lái)尋找基因治療瘢痕的最佳時(shí)間以及探討Smad信號(hào)通路與p38MAPK之間的cross-talk(交叉對(duì)話)情況。從整體水平闡明腺病毒介導(dǎo)的p38MAPK基因沉默對(duì)兔上唇瘢痕模型的治療性作用的分子機(jī)制。為開(kāi)拓對(duì)我國(guó)唇裂術(shù)后瘢痕增生高危人群的早期防治的新途徑奠定基礎(chǔ)。方法1.運(yùn)用Millard's單側(cè)唇裂修復(fù)法完成兔上唇瘢痕模型的構(gòu)建。2.分別在術(shù)后2、3、4、5周測(cè)量瘢痕體積并進(jìn)行肌成纖維細(xì)胞(MFB)的細(xì)胞計(jì)數(shù),隨后通過(guò)免疫組織化學(xué)染色和Western blot定性和定量檢測(cè)兔上唇瘢痕組織中α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)的含量。3.篩選p38MAPK基因沉默最有效shRNA序列及構(gòu)建腺病毒載體。4.術(shù)后0周、1周、2周分別進(jìn)行瘢痕組織p38MAPK基因沉默腺病毒轉(zhuǎn)染,然后在術(shù)后3周獲取標(biāo)本,用四種方法(天狼猩紅染色、免疫組織化學(xué)染色、Western blot、Real-time PCR)分別定性、定量檢測(cè)p38MAPK及瘢痕形成相關(guān)因子(colⅠ、colIII、MMP1、TIMP1)的蛋白和mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。5.Y 周時(shí),用 Western blot 和 Real-time PCR 檢測(cè) Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3、p38MAPK及p-p38MAPK的mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果1.成功構(gòu)建兔上唇唇裂術(shù)后瘢痕模型。2.瘢痕體積和MFB細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示,術(shù)后2周與術(shù)后5周,術(shù)后3周與術(shù)后4周無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),術(shù)后2周與術(shù)后3周及4周均有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)。免疫組化染色結(jié)果顯示:術(shù)后3周、4周瘢痕組織中α-SMA表達(dá)明顯多于術(shù)后2周、5周。Western blot結(jié)果顯示:術(shù)后3周、4周瘢痕組織中α-SMA蛋白表達(dá)較術(shù)后2周、5周增強(qiáng),結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.成功篩選出p38MAPK基因沉默最有效shRNA序列并構(gòu)建了腺病毒載體。4.局部注射腺病毒后,天狼猩紅染色結(jié)果示:術(shù)后1周瘢痕組織中colIII表達(dá)明顯多于術(shù)后0周及2周,術(shù)后1周瘢痕組織中colⅠ表達(dá)明顯少于術(shù)后0周及2周。免疫組化染色結(jié)果顯示:術(shù)后1周瘢痕組織中colIII、MMP1表達(dá)明顯多于術(shù)后0周及2周,術(shù)后1周瘢痕組織中colⅠ、TIMP1表達(dá)明顯少于術(shù)后0周及2周。Western blot結(jié)果顯示:術(shù)后1周瘢痕組織中colIII及MMP1蛋白較術(shù)后0周及2周表達(dá)增強(qiáng),術(shù)后1周瘢痕組織中p38MAPK、colⅠ及TIMP1蛋白較術(shù)后0周及2周表達(dá)減弱。Real-time PCR結(jié)果示:術(shù)后1周瘢痕組織中colⅢ及MMP1的mRNA水平較術(shù)后0周及2周升高,術(shù)后1周瘢痕組織中p38MAPK、colⅠ及TIMP1的mRNA水平較術(shù)后0周及2周降低。5.術(shù)后1周注射腺病毒,Western blot結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,術(shù)后1周瘢痕組織中p-Smad2、p-Smad3及p-p38MAPK蛋白表達(dá)降低。Real-time PCR結(jié)果示:術(shù)后1周瘢痕組織中Smad2、Smad3及p38MAPK的mRNA水平較對(duì)照組降低。結(jié)論為研究基因治療唇裂術(shù)后瘢痕增生提供了兔上唇瘢痕模型,通過(guò)實(shí)驗(yàn)可得術(shù)后3周及4周時(shí)瘢痕增生達(dá)最嚴(yán)重程度。在此之前1周局部注射腺病毒,靶基因沉默效果最佳,治療效果最好,并研究了 Smad與p38MAPK之間的cross-talk情況。從整體水平闡明腺病毒介導(dǎo)的p38MAPK基因沉默對(duì)兔模型上唇瘢痕的治療性作用的分子機(jī)制。為開(kāi)拓對(duì)我國(guó)唇裂術(shù)后瘢痕增生高危人群的早期防治的新途徑奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R782.2

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本文編號(hào)：2301953