發(fā)布時間：2018-03-03 16:42

  本文選題：HCMV　切入點：UL80.5裝配蛋白前體　出處：《武漢大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：人巨細胞病毒(Human cytomegalovirus, HCMV)與單純皰疹病毒1型(Herpes simplex virus, HSV-1)都是屬于皰疹病毒家族的DNA病毒,在人群中的感染率很高。HCMV是導(dǎo)致新生兒先天性畸形和智力障礙的最主要病毒因素,目前抗病毒藥物主要針對的是DNA聚合酶UL54,容易產(chǎn)生抗藥性。為了擴展新抗病毒藥物的研究思路,本文從病毒顆粒組裝和免疫逃逸這兩個病毒增殖過程中不可或缺的環(huán)節(jié)研究了病毒-宿主之間的相互作用。HSV-1病毒可在體內(nèi)引起長期潛伏感染,立即早期ICP4基因是調(diào)控其基因表達引發(fā)增殖性感染的關(guān)鍵激活因子。我們通過對靶向HSV-1病毒ICP4基因mRNA的EGSs研究探索了這種新型抗病毒技術(shù)抑制病毒基因表達及增殖的效果。人巨細胞病毒組裝蛋白前體UL80.5在病毒顆粒組裝中起著不可或缺的作用,與多種病毒衣殼蛋白相互作用,起始并調(diào)控整個組裝過程。本研究通過酵母雙雜篩選發(fā)現(xiàn)SUMO化(Small Ubiquitin-like Modify, SUMOylation,小泛素樣修飾)E2蛋白連接酶UBC9可以與UL80.5蛋白相互作用；UL80.5蛋白之后被證明可以被SUMO化,SUMO化位點為K371賴氨酸位點；通過競爭性免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn)增強UL80.5蛋白的SUMO化修飾可以抑制其與衣殼蛋白UL86的結(jié)合；UL80.5蛋白的SUMO化修飾缺失對病毒增殖略有抑制,但并不是重要影響因素。這些結(jié)果暗示HCMV病毒可能通過利用宿主細胞SUMO化系統(tǒng)幫助自身進行衣殼組裝,但這種需要并不是必不可少的。人巨細胞病毒UL84蛋白被認為是與裂解性復(fù)制的起始有關(guān)的重要蛋白,它通過靶向結(jié)合oriLyt RNA/DNA雜交區(qū)域的莖-環(huán)RNA序列發(fā)生作用。UL84蛋白除調(diào)控DNA復(fù)制外,根據(jù)其DExD/H-box家族同源的結(jié)構(gòu)分析還被認為有轉(zhuǎn)錄調(diào)控、RNA轉(zhuǎn)運等功能的可能性。本研究通過酵母雙雜篩選發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄輔助因子FHL2可以與UL84蛋白相互作用,且共定位于細胞核；UL84蛋白與FHL2蛋白的結(jié)合區(qū)域為400-586位氨基酸,該區(qū)域包含有DExD/H-box家族同源的walker B結(jié)構(gòu)域；雙熒光實驗顯示UL84蛋白對IFNP(干擾素β)的轉(zhuǎn)錄有抑制作用,而FHL2蛋白對IFNβ轉(zhuǎn)錄有增強作用,且這兩種結(jié)果相互拮抗。我們構(gòu)建了靶向HSV-1 (herpes simplex virus 1)主要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子ICP4蛋白mRNA的EGS,ICP4蛋白對于病毒早期和晚期基因表達及病毒增殖是必不可少的。EGS(External guide sequence)是一類特異識別與目標(biāo)mRNA形成與tRNA前體相似二級結(jié)構(gòu)的RNA序列,從而誘導(dǎo)內(nèi)源的核酶P切割靶向mRNA.本研究發(fā)現(xiàn)根據(jù)EGS篩選系統(tǒng)構(gòu)建的C468-A誘導(dǎo)核酶P切割I(lǐng)CP4基因mRNA的效率比根據(jù)天然前體tRNA結(jié)構(gòu)構(gòu)建的SER-A高60倍。在表達C468-A和SER-A的HSV-1病毒感染細胞中,ICP4基因表達分別下降大約97%和75%,病毒增殖抑制分別約7000和500倍。
[Abstract]:Human cytomegalovirus (HCMV) and herpes simplex virus type 1 (HSV-1) are DNA viruses belonging to the herpesvirus family. At present, antiviral drugs are mainly aimed at DNA polymerase UL54, which is easy to produce drug resistance. In order to expand the research ideas of new antiviral drugs, In this paper, we studied the interaction between virus and host. HSV-1 virus can cause long-term latent infection in vivo from the aspects of virus particle assembly and immune escape. Immediate and early ICP4 gene is the key activator to regulate its gene expression and induce proliferative infection. We explored this new antiviral technique to inhibit and increase the expression of ICP4 gene of HSV-1 virus by means of EGSs research on the target ICP4 gene of HSV-1 virus. Human cytomegalovirus assembly protein precursor UL80.5 plays an indispensable role in viral particle assembly. Interacting with a variety of viral capsid proteins, In this study, we found that SUMO small Ubiquitin-like modify, SUMOylation, small ubiquitin modified E 2 protein ligase UBC9 could interact with UL80.5 protein, and it was proved that the ligase UBC9 could be SUMO modified with UL80.5 protein. K371 lysine site; By competitive immunoprecipitation assay, it was found that enhancing the SUMO modification of UL80.5 protein could inhibit the SUMO modification deletion of capsid protein UL86 and inhibit the virus proliferation slightly. These results suggest that the HCMV virus may be helping to assemble its capsid by using the host cell SUMO system. But this need is not essential. The human cytomegalovirus UL84 protein is thought to be an important protein involved in the initiation of lytic replication. In addition to regulating the replication of DNA, it acts on the RNA sequence of stem loop by targeting the region of oriLyt RNA/DNA hybridization. According to the homologous structural analysis of its DExD/H-box family, it is also believed that it is possible to regulate the transcriptional translocation of UL84. In this study, we found that the transcriptional cofactor FHL2 can interact with UL84 protein by yeast double heterogeneity screening. Moreover, the binding region of FHL2 protein to UUL84 protein was 400-586 amino acids, which contained the walker B domain homologous to the DExD/H-box family, and the double fluorescence assay showed that UL84 protein could inhibit the transcription of IFNP- 尾. However, FHL2 protein enhanced IFN 尾 transcription. And these two kinds of results are antagonistic. We constructed the ICP4 protein mRNA, the main transcriptional regulator of HSV-1 herpes simplex virus 1, which is essential to the early and late gene expression and virus proliferation of the virus. Recognition of RNA sequences with target mRNA forming secondary structures similar to those of tRNA precursors. In this study, we found that the efficiency of C468-A induced ribozyme P cleavage of ICP4 gene mRNA was 60 times higher than that of SER-A constructed based on the structure of natural precursor tRNA. The expression of ICP4 gene in HSV-1 infected cells decreased by about 97% and 75, respectively, and the inhibition of virus proliferation was about 7000and 500-fold, respectively.
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R373

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本文編號：1561846