發(fā)布時間：2018-05-04 21:54

  本文選題：Cry1Ah蛋白 + 殺蟲特異性��； 參考：《中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院》2013年博士論文

【摘要】：蘇云金芽胞桿菌因其對多種害蟲具有殺蟲活性，不污染環(huán)境，對人畜無害，因而在害蟲的生物防治中得到了廣泛的應(yīng)用。cry1Ah1基因是本實(shí)驗(yàn)室分離克隆的具有自主知識產(chǎn)權(quán)的殺蟲基因，由于其編碼的Cry1Ah蛋白對多種鱗翅目害蟲具有較高的殺蟲活性，目前cry1Ah1基因被應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因玉米和水稻的研究中。 為了評價cry1Ah1基因?qū)Ψ前袠?biāo)昆蟲的安全性，本文首先對Cry1Ah蛋白對鱗翅目中重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲家蠶（Bombyxmori）進(jìn)行了活性測定，結(jié)果表明：Cry1Ah蛋白對家蠶的致死中濃度（LC50）大于500μg/mL。這不僅明確了對棉鈴蟲（Helicoverpaarmigera）等害蟲高毒力的Cry1Ah蛋白（LC50=7.04μg/g）對非靶標(biāo)昆蟲（家蠶）是安全低毒（LC50500μg/mL），更重要的是為cry1Ah1基因的推廣及應(yīng)用提供了理論依據(jù)。 Cry1Ah的這種特性恰恰與本實(shí)驗(yàn)室分離克隆的另一個擁有自主知識產(chǎn)權(quán)殺蟲基因cry1Ai相反，Cry1Ai蛋白對家蠶表現(xiàn)出很高的毒力（LC50=5.25μg/mL），但對棉鈴蟲則表現(xiàn)出較低的活性（LC50500μg/g），而兩者的氨基酸相似性為84%，并且擁有相似的三維結(jié)構(gòu)�；�于這種發(fā)現(xiàn)，本研究旨在揭示Cry1Ah蛋白對棉鈴蟲等農(nóng)業(yè)害蟲高毒力、對經(jīng)濟(jì)昆蟲家蠶相對安全低毒的分子機(jī)制。 本文以Cry1Ah蛋白為研究重點(diǎn)，以Cry1Ai蛋白為對照材料，一方面通過構(gòu)建定點(diǎn)突變體、截短片段以及Loop突變體，明確Cry1Ah蛋白殺蟲活性相關(guān)位點(diǎn)、Cry1Ai蛋白的殺蟲活性區(qū)域，以及兩者與殺蟲特異性相關(guān)的Loop區(qū)域。另一方面，利用配體垂釣平臺分別分析Cry1Ah蛋白和Cry1Ai蛋白在棉鈴蟲和家蠶刷狀緣膜微囊泡（BrushBorderMembraneVesicles，簡稱BBMVs）上的特異性結(jié)合蛋白。主要研究結(jié)果如下： （1）利用定點(diǎn)突變的方法構(gòu)建了Cry1Ah蛋白DomainⅠ和DomainⅡ上7個突變體，對比Cry1Ah蛋白對棉鈴蟲的生物活性發(fā)現(xiàn)，Cry1Ah蛋白DomainⅠ中α-6螺旋上第206位氨基酸突變?yōu)楸�氨酸時，其對棉鈴蟲的殺蟲活性略有降低，而在DomainⅡ上Loop3的第463位添加多個天冬酰胺時，能夠降低其對棉鈴蟲的殺蟲活性。 （2）構(gòu)建了26個Cry1Ai蛋白的截短片段，通過對小菜蛾的生物活性測定，將Cry1Ai蛋白對小菜蛾（Plutellaxylostella）的最小活性區(qū)域精準(zhǔn)定位為第36I到605I氨基酸殘基。 （3）通過分析比較Cry1Ah/Cry1Ai毒素在棉鈴蟲和家蠶中腸BBMVs上的結(jié)合蛋白，探尋結(jié)合蛋白與殺蟲特異性的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，Cry1Ah蛋白與棉鈴蟲BBMVs上的氨肽酶N（AminopeptidaseN，簡稱APN）能夠特異的結(jié)合，而在家蠶的BBMVs上沒有檢測到這種高親和力的結(jié)合，這可能是Cry1Ah蛋白對棉鈴蟲殺蟲特異性的原因。而Cry1Ai蛋白在家蠶的BBMVs上也存在一些特異的結(jié)合蛋白，但這些結(jié)合蛋白仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。 （4）為了進(jìn)一步確定Cry1Ah蛋白與棉鈴蟲APN特異性結(jié)合的原因，本研究分析比較Cry1Ah蛋白和Cry1Ai蛋白的氨基酸序列和三維結(jié)構(gòu)，研究發(fā)現(xiàn)，兩者在受體結(jié)合區(qū)域的主要差別在DomainⅡ的Loop2和Loop3上，通過構(gòu)建Loop互換突變體，以及比較突變體的生物活性，發(fā)現(xiàn)Cry1Ah和Cry1Ai蛋白Loop2的互換使得Cry1Ai蛋白獲得了對棉鈴蟲的殺蟲活性（Cry1Ai-hloop2：LC50=64.23μg/g），而Cry1Ah蛋白則失去了對棉鈴蟲的殺蟲活性（Cry1Ah-iloop2：LC50500μg/g）；但Loop2的互換并沒有改變兩種蛋白對家蠶原有活性（Cry1Ai-hloop2：LC50=11.60μg/mL；Cry1Ah-iloop2：LC50500μg/mL），這說明DomainⅡ的Loop2與棉鈴蟲殺蟲特異性密切相關(guān)。而兩個蛋白Loop3互換時，不但沒有使Cry1Ai蛋白沒有獲得對棉鈴蟲的殺蟲活性（Cry1Ai-hloop3：LC50500μg/g），反而導(dǎo)致Cry1Ah蛋白失去了對棉鈴蟲的殺蟲活性（Cry1Ah-iloop3：LC50500μg/g），這說明Loop3對Cry1Ah和Cry1Ai蛋白保持原有的對棉鈴蟲的殺蟲活性比較重要。 Cry1Ah蛋白對非靶標(biāo)昆蟲（家蠶）安全性的明確，，將有利于cry1Ah1基因的推廣應(yīng)用，同時也為新型cry基因的發(fā)掘和應(yīng)用提供篩選和評價標(biāo)準(zhǔn)；Cry1Ah蛋白殺蟲特異性相關(guān)受體的確定，以及Cry1Ah蛋白上與殺蟲特異性相關(guān)氨基酸區(qū)域的明確，初步揭示了Cry1Ah蛋白對棉鈴蟲殺蟲特異性的分子機(jī)制，為cry1Ah1基因的推廣應(yīng)用奠定了堅實(shí)的理論基礎(chǔ)，同時也為其它Cry蛋白的定向改造提供重要借鑒。
[Abstract]:The Bacillus thuringiensis has the insecticidal activity to many kinds of pests, does not pollute the environment and is harmless to the human and animal. Therefore, the.Cry1Ah1 gene has been widely used in the biological control of the pests. It has the independent intellectual property of the insecticidal gene, which is isolated and cloned in our laboratory. Because of its coding Cry1Ah protein, it has a better effect on a variety of Lepidoptera pests. High insecticidal activity, the cry1Ah1 gene has been applied to the research of transgenic maize and rice.
In order to evaluate the safety of cry1Ah1 gene for non target insects, the activity of Cry1Ah protein to the important economic insect (Bombyxmori) in Lepidoptera (Bombyxmori) was measured. The results showed that the lethal concentration of Cry1Ah protein (LC50) was greater than 500 mu g/mL., which was not only clear to the high insect pests of cotton bollworm (Helicoverpaarmigera) and so on. The toxic Cry1Ah protein (LC50=7.04 g/g) is a safe and low toxicity (LC50500 mu g/mL) to the non target insect (silkworm), and more importantly, it provides a theoretical basis for the promotion and application of cry1Ah1 gene.
This characteristic of Cry1Ah is the opposite of another independent intellectual property killing gene cry1Ai, which is cloned in our laboratory. Cry1Ai protein shows a high toxicity (LC50=5.25 mu g/mL) to silkworm, but it shows a lower activity (LC50500 mu g/g) to the cotton bollworm (LC50500 mu g/g), and the two amino acid similarity is 84%, and it has a similar three dimension. Structure. Based on this discovery, this study aims to reveal the high toxicity of Cry1Ah protein to cotton bollworm and other agricultural pests, and the molecular mechanism of relatively safe and low toxicity to the Bombyx mori.
In this paper, we focus on Cry1Ah protein and use Cry1Ai protein as the control material. On the one hand, by constructing the fixed-point mutants, truncated fragments and Loop mutants, the insecticidal activity related sites of Cry1Ah protein, the insecticidal activity region of Cry1Ai protein and the Loop region related to the specificity of the insecticides are also identified. On the other hand, the ligands are angled by the ligands. The specific binding proteins of Cry1Ah protein and Cry1Ai protein in the BrushBorderMembraneVesicles (BBMVs) of cotton bollworm and Bombyx mori were analyzed respectively. The main results were as follows:
(1) 7 mutants on Cry1Ah protein Domain I and Domain II were constructed by site directed mutagenesis, and the bioactivity of Cry1Ah protein to Helicoverpa armigera was compared. When Cry1Ah protein Domain I mutated to alanine with 206th amino acids on the alpha -6 spiral, the insecticidal activity of Cry1Ah protein to Helicoverpa armigera was slightly reduced, and 463rd bits of Loop3 in Domain II were added. Adding asparagine can reduce its insecticidal activity against Helicoverpa armigera.
(2) the truncated fragments of 26 Cry1Ai proteins were constructed. By measuring the bioactivity of the diamondback moth, the Cry1Ai protein was accurately positioned as the 36I to 605I amino acid residues in the smallest active region of the Plutella xylostella (Plutellaxylostella).
(3) through the analysis and comparison of the binding proteins of Cry1Ah/Cry1Ai toxin on BBMVs in the midgut of Helicoverpa armigera and silkworm, the relationship between binding proteins and insecticidal specificity was explored. It was found that the Cry1Ah protein and the aminopeptidase N (AminopeptidaseN, APN) on the BBMVs of cotton bollworm could be specifically bonded, but the high affinity was not detected on the BBMVs of the silkworm. The combination of forces may be the reason for the specificity of Cry1Ah protein against Helicoverpa armigera, and the Cry1Ai protein also has some specific binding proteins in the BBMVs of the silkworm, but these binding proteins still need to be further verified.
(4) in order to further determine the reason for the specific binding of Cry1Ah protein to the APN of cotton bollworm, this study compared the amino acid sequence and three-dimensional structure of Cry1Ah protein and Cry1Ai protein. It was found that the main differences in the receptor binding regions were on the Loop2 and Loop3 of Domain II, by constructing Loop exchange mutants and comparison mutants. It was found that the exchange of Cry1Ah and Cry1Ai Loop2 made the Cry1Ai protein obtain the insecticidal activity (Cry1Ai-hloop2:LC50=64.23, g/g) to cotton bollworm, while the Cry1Ah protein lost the insecticidal activity (Cry1Ah-iloop2:LC50500 u g/g) to the cotton bollworm (Cry1Ah-iloop2:LC50500 u g/g), but the exchange of Loop2 did not change the original activity of the two proteins to the silkworm (C). Ry1Ai-hloop2:LC50=11.60 mu g/mL; Cry1Ah-iloop2:LC50500 mu g/mL), which indicates that Loop2 of Domain II is closely related to the specificity of insecticidal specificity of Helicoverpa armigera. While the two protein Loop3 exchange, not only does not make Cry1Ai protein do not obtain the insecticidal activity (Cry1Ai-hloop3:LC50500 mu g/g) to cotton bollworm (Cry1Ai-hloop3:LC50500 micron g/g), but the Cry1Ah protein is lost to the cotton. The insecticidal activity of Bollworm (Cry1Ah-iloop3:LC50500 g/g) indicates that Loop3 is more important for Cry1Ah and Cry1Ai proteins to maintain their original insecticidal activity against Helicoverpa armigera.
The definite safety of Cry1Ah protein to non target insect (silkworm) will be beneficial to the promotion and application of cry1Ah1 gene. It also provides screening and evaluation criteria for the discovery and application of new cry genes, the determination of Cry1Ah protein specific receptor related to insecticides, and the clear region of the specific amino acid related to the insecticidal protein on the Cry1Ah protein. The molecular mechanism of Cry1Ah protein to insecticidal specificity of Helicoverpa armigera was revealed, which laid a solid theoretical basis for the promotion and application of cry1Ah1 gene, and also provided an important reference for the directional transformation of other Cry proteins.

【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：S476.1

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 劉京國;趙曉萌;楊愛珍;于同泉;路蘋;師光祿;;棉鈴蟲氨肽酶N基因片段克隆、表達(dá)和內(nèi)源蛋白檢測[J];北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報;2010年01期

2 常洪雷;梁革梅;于宏坤;王桂榮;吳孔明;郭予元;;棉鈴蟲Bt毒素受體蛋白—氨肽酶N與抗性的關(guān)系[J];植物保護(hù);2007年01期

3 宗希重;楊樹枝把為什么能誘集棉鈴蟲蛾?[J];農(nóng)業(yè)科技通訊;1979年07期

4 張近光;棉鈴蟲的生活習(xí)性及發(fā)生規(guī)律[J];江西農(nóng)業(yè)科技;1986年06期

5 R.V.Gunning;C.S.Easton;李世友;;澳大利亞棉鈴蟲對擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的抗性[J];世界農(nóng)藥;1986年02期

6 呂建萍;一代棉鈴蟲發(fā)蛾早、蛾量大[J];植物保護(hù);1993年04期

7 王篤兵;棉鈴蟲猖獗為害蘋果[J];昆蟲知識;1994年02期

8 卞國新;如何提高棉鈴蟲的防治效果[J];中國棉花;1994年09期

9 吳孔明,郭予元;營養(yǎng)對棉鈴蟲發(fā)育積溫的影響[J];植物保護(hù);1994年04期

10 趙秀芹，薛國杰;平原果園棉鈴蟲的防治[J];山西果樹;1994年01期

相關(guān)會議論文 前10條

1 陳齊信;;生物農(nóng)藥Bt防治棉鈴蟲效果的研究[A];棉花重大病蟲統(tǒng)一防治的理論與實(shí)踐[C];2004年

2 劉定忠;王榮龍;余昌喜;;贛北棉鈴蟲抗藥性及其治理對策的研究[A];棉花重大病蟲統(tǒng)一防治的理論與實(shí)踐[C];2004年

3 董利霞;芮昌輝;譚曉偉;;棉鈴蟲對甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽的抗藥性風(fēng)險及交互抗性研究[A];公共植保與綠色防控[C];2010年

4 ;棉鈴蟲防治工作總結(jié)[A];植病、昆蟲學(xué)會通訊3[C];2002年

5 李權(quán)生;朱世華;范愛華;羅國平;;望江縣棉花棉鈴蟲發(fā)生特點(diǎn)、爆發(fā)因子及防治對策[A];棉花重大病蟲統(tǒng)一防治的理論與實(shí)踐[C];2004年

6 梁光浙;鄭大寬;;江西棉鈴蟲世代劃分的研究[A];棉花重大病蟲統(tǒng)一防治的理論與實(shí)踐[C];2004年

7 王增君;張福遠(yuǎn);韋國慶;宋憲玉;張青;謝來泉;;棉鈴蟲抗藥性監(jiān)測及綜合治理技術(shù)研究[A];棉花重大病蟲統(tǒng)一防治的理論與實(shí)踐[C];2004年

8 楊秋萍;何永垠;李瑛;丁志寬;;蘇北沿海棉區(qū)棉鈴蟲抗藥性監(jiān)測及治理技術(shù)初探[A];棉花重大病蟲統(tǒng)一防治的理論與實(shí)踐[C];2004年

9 魏國樹;張青文;蔡青年;周明rB;;燈光誘蛾量與棉鈴蟲自然種群數(shù)量的關(guān)系及影響因子分析[A];走向21世紀(jì)的中國昆蟲學(xué)——中國昆蟲學(xué)會2000年學(xué)術(shù)年會論文集[C];2000年

10 周訓(xùn)芝;朱志良;呂衛(wèi)東;尹學(xué)仁;武進(jìn)龍;田子華;張紹明;;棉鈴蟲統(tǒng)防統(tǒng)治產(chǎn)業(yè)化模式實(shí)施與效益[A];棉花重大病蟲統(tǒng)一防治的理論與實(shí)踐[C];2004年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 省植�？傉緶y報科 席建英;第四代棉鈴蟲要來了[N];河北科技報;2006年

2 記者 高燕;防治棉鈴蟲措施要到位[N];新疆科技報(漢);2007年

3 耿挺;讓棉鈴蟲失去解毒能力[N];大眾科技報;2007年

4 沈瑞;棉鈴蟲對菊酯類農(nóng)藥的抗性及對策[N];瓜果蔬菜報.農(nóng)業(yè)信息周刊;2007年

5 徐生海;玉米棉鈴蟲進(jìn)入危害高峰期[N];武威日報;2007年

6 通訊員 尚松華;精河縣全力防治棉鈴蟲[N];博爾塔拉報;2008年

7 ;如何提高棉鈴蟲防治效果[N];瓜果蔬菜報.農(nóng)業(yè)信息周刊;2008年

8 通訊員 李紅梅 遲浩;認(rèn)真做好棉鈴蟲發(fā)生預(yù)測預(yù)報及防治工作[N];喀什日報(漢);2006年

9 通訊員 楊奇德 李采弟;疏勒縣牙甫泉鎮(zhèn)采取措施防治棉鈴蟲害[N];喀什日報(漢);2008年

10 玉堂;秋冬抓深耕 可滅棉鈴蟲[N];陜西科技報;2008年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 周子珊;Cry1Ah蛋白殺蟲特異性分子機(jī)制的研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2013年

2 劉芳芳;SPR傳感檢測細(xì)胞表面分子相互作用的方法研究[D];清華大學(xué);2010年

3 杜婧;胰島素降解酶表達(dá)調(diào)控機(jī)制及其在阿爾茨海默病中的應(yīng)用[D];清華大學(xué);2009年

4 魯云霞;人PTP1B克隆表達(dá)及豹皮樟總黃酮治療2型糖尿病大鼠部分機(jī)制的研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2009年

5 畢淑云;藥物與生物分子相互作用的光譜法研究[D];吉林大學(xué);2006年

6 單寧寧;IL-18/IL-18BP在ITP發(fā)病機(jī)制中的調(diào)控及其免疫干預(yù)作用探討[D];山東大學(xué);2010年

7 焦緒棟;遲緩愛德華氏菌基因工程疫苗的構(gòu)建及免疫效果的研究[D];中國科學(xué)院研究生院（海洋研究所）;2010年

8 宗萬松;環(huán)境氧化應(yīng)激誘發(fā)蛋白質(zhì)（多肽）氧化損傷評價新方法的研究[D];山東大學(xué);2011年

9 王蓉蓉;遺傳性心律失常的分子機(jī)制研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2011年

10 李永強(qiáng);棉鈴蟲羧酸酯酶表達(dá)及解毒作用研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2012年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 陳法軍;蛹期土壤水分狀況對棉鈴蟲生長發(fā)育和繁殖的影響[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2001年

2 楊燕濤;降雨對棉鈴蟲化蛹和羽化的影響機(jī)制及對發(fā)生程度的抑制作用研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2000年

3 高宇;棉鈴蟲Cry1A新受體蛋白的鑒定及與抗性的關(guān)系[D];東北林業(yè)大學(xué);2010年

4 魏巍;棉鈴蟲幾丁質(zhì)酶cDNA克隆及表達(dá)研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2002年

5 張欣;棉鈴蟲甾醇載體蛋白2（SCP-2）基因的鑒定和功能研究[D];華中師范大學(xué);2010年

6 李杰;棉鈴蟲中腸靶標(biāo)蛋白的分離與鑒定[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

7 宋萍;Bt Cry1Ac毒蛋白對棉鈴蟲和粘蟲作用機(jī)理研究[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2003年

8 劉慕蘭;棉鈴蟲卵上抑卵物質(zhì)的化學(xué)組成和生物活性[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2004年

9 劉小寧;新疆寄生棉鈴蟲的赤眼峰品系篩選[D];新疆農(nóng)業(yè)大學(xué);2001年

10 何丹軍;檢測棉鈴蟲對Bt基因的抗性等位基因頻率及建立新的檢測方法[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2000年

本文編號：1844821