【摘要】 目的：采用多種方法對亳菊總黃酮進行藥效學的初步研究；通過藥代動力學和心肌缺血實驗比較亳菊總黃酮（TF）及納米乳（TF-NE）。方法：采用DPPH法測定亳菊總黃酮清除自由基的能力；采用腹腔注射STZ制備大鼠糖尿病模型，觀察亳菊總黃酮對糖尿病大鼠凝血時間，體外血栓長度及干、濕重，全血和血漿粘度，紅細胞壓積和紅細胞沉降速率，以及血清一氧化氮（NO）含量的影響。采用HPLC梯度洗脫，同時測定亳菊總黃酮中三種黃酮苷元成分；制備成亳菊總黃酮納米制劑，建立了測定大鼠生物樣本處理和測定的方法學，并對TF、TF-NE進行了藥代動力學研究。采用冠脈結扎法建立大鼠心肌缺血模型，測定血清酶（AST、LDH、CK）活性、凝血時間以及梗死率，比較亳菊總黃酮與納米乳的差異。結果：亳菊總黃酮具有較強的抗DPPH自由基作用；亳菊總黃酮能顯著延長糖尿病大鼠凝血時間，降低體外血栓長度和干、濕重，降低紅細胞壓積，減慢紅細胞沉降速率，升高血清NO含量；實現(xiàn)了RP-HPLC同時測定亳菊總黃酮中木犀草素、芹菜素和金合歡素3種黃酮苷元成分；對亳菊總黃酮納米乳進行表征，其平均粒徑在83.16±12.03nm，zeta電位為-（11.62±6.38）mV，粒徑范圍較窄，體系較穩(wěn)定；經透射電鏡(TEM)對TF-NE進行形貌觀察，制劑成球形或類球形，粒徑分布較均勻，無粘連。大鼠灌胃TF-NE與TF-相比，血漿中木犀草素和芹菜素的Tmax都有所推后、吸收半衰期和消除半衰期一定程度的延長、峰濃度Cmax有一定的增加，TF-NE中木犀草素的AUC是原料藥的2.52倍，納米乳中芹菜素的AUC是原料藥的3.62倍；木犀草素和芹菜素的相對生物利用度分別為313%和318%。與模型組相比，灌胃TF與TF-NE大鼠血清酶（AST、LDH、CK）活性都有所降低、凝血時間延長、梗死率也有降低，但TF組與TF-NE之間無明顯差異。結論：亳菊總黃酮具有抗自由基、抗氧化、改善糖尿病大鼠血液流變學異常的作用。首次采用有效部位——亳菊總黃酮作為藥物做成納米制劑，并使用多指標成分做指標來進行藥動學研究。納米乳能提高總黃酮的生物利用度，TF與TF-NE均具有對抗大鼠急性心肌缺血的作用。 

前 言

隨著人們生活水平及質量的不斷提高，人民的飲食結構的改變，心腦血管疾病的發(fā)病率也呈上升趨勢。其危害人類尤其是中老年人的健康，死亡率居各種疾病之首。據(jù)有關數(shù)據(jù)調查，我國由心腦血管引起的死亡人數(shù)占總死亡人數(shù)的40%左右，藥品市場半數(shù)藥物為心血管病。因此對治療和預防心腦血管疾病的藥品與保健品的開發(fā)研究就顯得尤為重要。
心肌缺血易引發(fā)缺血性心臟病，常伴有血液流變性異常[1]。心肌缺血易引起心肌細胞溶解死亡以及自律性細胞節(jié)律的改變，還會出現(xiàn)血漿中酶含量變化。當心肌缺血在短時間內會發(fā)生心肌頓抑；血管內皮細胞損傷會使血管栓塞、官腔狹窄，從而引起冠脈堵塞，易引起心肌缺血、缺氧。心臟血液流動如果不暢，就沒有足夠的氧和營養(yǎng)物質來維持心臟組織的活力。持續(xù)一段時間后會引發(fā)心肌梗死、心律失常等癥狀。而心肌梗塞會伴有血液流變學的異常改變，表現(xiàn)為血液、血漿的粘度升高，血沉和壓積的增加、紅細胞聚集性增加、以及血小板聚集，以致血液循環(huán)阻力增加，造成心肌供血不足，嚴重的可以造成組織細胞壞死。
氧化反應廣泛存在，自由基是生物體在新陳代謝時奪走氧原子中的電子，使氧原子變成自由基，能夠攻擊細胞組織中的脂質、蛋白質、糖類和 DNA 等物質，通過奪取失去的電子達到新平衡，細胞分子失去電子后又形成新的自由基，造成連鎖反應會導致細胞膜、遺傳因子等的損傷，從而引發(fā)嚴重的疾病。此外，自由基含脂類成分食品酸敗——脂質過氧化，使油脂營養(yǎng)喪失，并損害生物膜、蛋白質與活細胞功能，這些產物中有些還是公認的致癌物。許多疾病的產生都與氧化有一定的關系，血液成分中的一些物質能氧化成為過氧化物質，經小腸吸收，通過血液等途徑流入機體的組織中產生有害作用。尤其是過氧化脂質會損傷血管細胞內壁，阻礙血液的循環(huán)，從而導致腦出血、動脈硬癥狀的產生。同時，細胞內產生的過氧化脂質易損傷細胞膜與局部組織，自由基還能抑制前列腺素的合成引發(fā)血栓，通過形成脂褐素使細胞老化。為了加強防御系統(tǒng)，減少氧化傷害，就必須從體外補充一些抗氧化物質，如食品類抗氧化成分有維生素 C、維生素 E 等；天然抗氧劑有黃酮類、苯酚類、鞣質類、皂苷類等。經證實合成抗氧化劑有致癌作用，由于天然的抗氧成分來源廣泛、安全健康，因此從天然產物中尋找更加安全有效的抗氧化劑成為更多國內外學者的共同研究的對象。
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第一章 亳菊總黃酮藥效學的初步評價

第一節(jié) DPPH法測定亳菊總黃酮的抗氧化活性
采用 DPPH 法測定亳菊總黃酮的抗氧化作用。DPPH 在有機溶液中是一種穩(wěn)定的自由基，該溶液特征是紫紅色團的吸收峰，具有極強的氧化性。采用比色法測定 DPPH 的吸光度，以加入亳菊總黃酮溶液使其吸光度在 517nm 下的吸光度下降的影響來確定黃酮溶液對 DPPH 的清除能力，以清除率表示[19-24]。測定自由基的清除作用，可以反映其抗氧化活性。經測定結果顯示亳菊總黃酮具有較強的抗氧化性，對其進一步研究保護體內局部區(qū)域損傷提供依據(jù)。
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1 儀器與材料
1.1 儀器
UV-757CRT 紫外分光光度計(上海棱光儀器有限公司)；CP-225D 電子分析天平（德國賽多利斯儀器有限公司）；HH-S2 恒溫水浴鍋（上海醫(yī)療器械五廠制造）；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（鞏義市英峪予華儀器廠）；DZF-200 型真空干燥箱（上海浦東躍欣科學儀器廠）；KP3200B 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。
1.2 材料
亳菊總黃酮（自制，總黃酮含量為 76.3%）；DPPH(1，1－二苯基苦基苯肼)（梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司，批號 00909，純度 HPLC≧98%）；蘆丁對照品（自制，純度 HPLC≧98%）；甲醇（MeOH）、乙醇(EtOH)為分析純；水為重蒸餾水。
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第二章 亳菊總黃酮的質量控制及納米乳的制備............... 30-44 
第一節(jié) 總黃酮原料藥的質量控制 ...................30-39 
1 儀器與材料................ 30 
2 方法和結果 .................................30-37 
3 討論 .............................37 
4 小結 ..........................37-39 
第二節(jié) 亳菊總黃酮納米乳的制備與質量評價 ................39-44 
1 儀器與材料....................................... 39 
2 方法和結果 ..........................39-42 
3 討論............................ 42-43 
4 結論............................. 43-44 
第三章 亳菊總黃酮與納米乳制劑代動力學比較研究............... 44-60 
1 儀器與材料.......................... 44 
2 方法和結果 ...........................44-58 
3 討論......................... 58 
4 結論............................... 58-60 

第四章 亳菊總黃酮及其納米乳制劑抗急性心肌缺血實驗

比較亳菊總黃酮及其納米制劑的對心肌損傷的保護作用。采用冠脈結扎法建立心肌缺血大鼠模型，對比大鼠灌胃 TF 及其 TF-NE 心電圖、血清心肌酶（AST、LDH、CK）含量、TTC 染色測定梗死率及凝血時間（PT、APTT）的差異。TF 及其 TF-NE 能對抗冠脈結扎引發(fā)大鼠急性心肌缺血模型的心電圖 ST 段的抬高，降低血清心肌酶（AST、LDH、CK）活性，明顯縮短凝血時間。但 TF 與 TF-NE 之間無明顯差異。
1 儀器與材料
1.1 儀器
XD-7100 型單道心電圖機（上海醫(yī)用電子儀器廠），恒溫水浴鍋。
1.2 藥品與試劑
亳菊總黃酮（自制，，總黃酮含量為 76.3%）；紅四氮唑（TTC，BIOSHARP 公司，批號：0765）；復方丹參滴丸（天津天士力制藥股份有限公司，批號：110361）。
1.3 實驗動物
Wistar 大鼠(購自安徽醫(yī)科大學實驗動物中心)，雌雄各半，體重 200~220g，飼養(yǎng)環(huán)境為清潔級。
2 方法與結果
2.1 動物分組與給藥
實驗動物分為 5 組，隨機分成假手術組、模型組、陽性組（復方丹參滴丸，140mg/kg）、亳菊總黃酮（TF）組（400mg/kg）、亳菊總黃酮納米乳（TF-NE）組（400mg/kg）每組 14 只。術前連續(xù) 7 天灌胃給藥，每天 1 次共 7 天。各組動物按劑量灌胃給藥，按體重給予相應體積，假手術組、模型組給予 10mL/kg 等容量的0.5%CMC-Na 溶液。
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總結

通過DPPH法實驗證明了菊花總黃酮有清除DPPH自由基作用，本法操作簡單，快速，準確，用樣量小，為研制天然抗氧化劑以及深入研究藥理作用提供依據(jù)。
通過大鼠血液流變學實驗，明確亳菊總黃酮降低體外血栓長度和干、濕重，降低紅細胞壓積，減慢紅細胞沉降速率，升高血清 NO 含量。因此亳菊總黃酮能夠改善大鼠血液流變學異常。
建立心肌缺血模型，初步確定亳菊總黃酮對冠脈結扎所致的心肌缺血具有保護作用。
對亳菊總黃酮原料藥進行質量控制，HPLC同時測定其中的三種黃酮苷元成分——木犀草素、芹菜素、金合歡素，并制備了亳菊總黃酮納米制劑。同時進行藥動學比較，發(fā)現(xiàn)大鼠灌胃后納米乳兩種苷元成分不同的劑型藥物代謝動力學參數(shù)有變化，峰值Cmax有一定增加，達峰時間Tmax、血藥濃度維持時間分別延長，曲線下面積有所增加，生物利用度有不同程度的提高。
通過心肌缺血模型實驗對比亳菊總黃酮及其納米制劑，研究使用冠脈結扎法引發(fā)心肌缺血模型，以心電圖ST段的抬高顯示心肌缺血模型的建立，以手術后ST段降低程度反映藥物對心肌損傷的保護能力，以心肌酶指標判斷心肌的傷程度，以梗塞率確定藥物降低心肌細胞壞死的能力。證明亳菊總黃酮及其納米乳對大鼠急性心肌缺血模型有不同程度的保護作用。
藥效學初步評價實驗中，所做的血液流變學實驗中總黃酮的濃度是參照相關的文獻暫定的劑量為30，60，120mg/kg。而后來實驗過程考慮到藥動實驗初步采用了TF-NE的最大載藥量為400mg/kg，因此心肌缺血藥理實驗同樣采用相同的劑量400mg/kg。
菊總黃酮具有抗自由基、抗氧化、改善糖尿病大鼠血液流變學異常的作用。首次采用有效部位——亳菊總黃酮作為藥物做成納米制劑，并使用多指標成分做指標來進行藥動學研究。納米乳能提高總黃酮的生物利用度，TF與TF-NE均具有對抗大鼠急性心肌缺血的作用。
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參考文獻（略）