發(fā)布時間：2018-08-27 19:09

【摘要】：第一部分：胰腺癌MAPK與PI3K信號通路存在串話目的：研究胰腺癌MAPK與P13K信號通路間是否存在串話及其作用方式。方法：分別向胰腺癌BxPC3、 PANC1細胞株中加入MAPK通路抑制劑PD98059或P13K通路抑制劑LY294002干預(yù)1 h,免疫印跡方法檢測p-ERK、 ERK、 p-Akt、 AKt的蛋白表達水平。應(yīng)用siRNA方法降低ERK表達水平,免疫印跡方法檢測p-Akt、Akt的蛋白表達水平。結(jié)果：應(yīng)用MAPK抑制劑抑制BxPC3、 PANC1細胞ERK活性后,p-Akt表達水平反而升高。使用siRNA轉(zhuǎn)染BxPC3、 PANC1細胞沉默ERK的表達同樣可以使p-Akt的蛋白表達水平升高。結(jié)論：胰腺癌MAPK, PI3K信號通路間存在串話,ERK的活化可以抑制PI3K/Akt信號通路的激活。第二部分：FoG2在胰腺癌中的表達及其在MAPK、 PI3K信號通路串話中的作用目的：研究FOG2在胰腺癌組織中的表達,及其調(diào)控MAPK、 PI3K信號通路串話的機制。方法：采用免疫組織化學(xué)方法檢測108例臨床胰腺癌樣本中FOG2的蛋白含量。使用免疫印跡方法檢測多種胰腺癌細胞株FOG2的蛋白表達水平,選擇FOG2高表達細胞株a應(yīng)用慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染胰腺癌細胞降低FOG2表達,對照組應(yīng)用空白慢病毒載體。分別應(yīng)用MAPK和P13K抑制劑抑制通路活性,免疫印跡方法檢測p-ERK.ERK、p-Akt,Akt的蛋白表達水平。通過免疫共沉淀(Co-IP)方法,檢測ERK與FOG2有無結(jié)合。結(jié)果：61.1%(66/108)患者的胰腺癌組織FOG2表達水平要強于對應(yīng)的癌旁組織。FOG2在BxPC3、PANC1細胞中呈高表達。在對照組,抑制ERK的磷酸化可以顯著增加Akt的磷酸化,活化的ERK可以抑制Akt的活化；應(yīng)用慢病毒轉(zhuǎn)染方法降低FOG2表達水平后,應(yīng)用MAPK抑制劑抑制ERK活性,p-Akt的蛋白表達水平并沒有明顯變化。免疫共沉淀結(jié)果顯示,ERK可以與FOG2特異性結(jié)合。結(jié)論：大多數(shù)胰腺癌腫組織中FOG2蛋白的表達水平要強于癌旁組織。ERK通過與FOG2特異性結(jié)合來調(diào)控Akt的活化。沉默F(xiàn)OG2可以干擾ERK對Akt信號通路的抑制作用。FOG2是調(diào)控胰腺癌MSPK、 PI3K信號通路串話的重要分子。第三部分：沉默F(xiàn)oG2對MAPK抑制劑作用效果的影響目的：研究沉默F(xiàn)OG2對MAPK抑制劑抑制胰腺癌細胞生物學(xué)行為的能力有無影響。方法：向慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的BxPC3、PANC1細胞中加入MAPK抑制劑,采用Transwell小室測定BxPC3、PANC1細胞的定向遷移能力,Flow Cytometry檢測BxPC3、 PANC1的凋亡比例,采用平板克隆形成實驗測定BxPC3、 PANC1細胞的成瘤能力,MTT檢測BxPC3、 PANC1增殖能力。結(jié)果：Transwell assay結(jié)果顯示,雖然沉默F(xiàn)OG2對BxPC3、 PANC1細胞的定向遷移能力沒有明顯影響,但沉默F(xiàn)OG2表達后,無論是單用MAPK通路抑制劑還是與P13K通路抑制劑聯(lián)合應(yīng)用,其抑制BxPC3、 PANC1細胞遷移的能力均得到增強。流式細胞術(shù)和平板克隆形成實驗結(jié)果分別提示沉默F(xiàn)OG2可以增強PD98059對BxPC3、 PANC1細胞的促凋亡作用和抑制BxPC3、 PANC1細胞成瘤的能力。MTT結(jié)果顯示,沉默F(xiàn)OG2后,PD98059抑制BxPC3、 PANC1細胞增殖的作用強度和持續(xù)時間均得到增強。結(jié)論：沉默F(xiàn)OG2可以增加胰腺癌細胞對ERK抑制劑的敏感性,可以增強MAPK抑制劑抑制BxPC3、 PANC1細胞增殖、存活、定向遷移和集落形成的能力。
[Abstract]:Part I: There is a crosstalk between MAPK and PI3K signaling pathway in pancreatic cancer. Objective: To study whether there is a crosstalk between MAPK and P13K signaling pathway in pancreatic cancer and its mechanism. The expression levels of ERK, p-Akt and AKt were decreased by siRNA, and the expression levels of p-Akt and Akt were detected by Western blotting. Results: The expression level of p-Akt was increased by using MAPK inhibitor to inhibit the ERK activity of BxPC3 and PANC1 cells. Conclusion: The activation of ERK can inhibit the activation of PI3K / Akt signaling pathway. Part II: FoG2 expression in pancreatic cancer and its role in MAPK, PI3K signaling pathway crosstalk. Objective: To study the expression of FOG2 in pancreatic cancer and its regulation of MAPK. Methods: Immunohistochemical method was used to detect FOG2 protein content in 108 clinical pancreatic cancer samples. Immunoblotting was used to detect FOG2 protein expression in various pancreatic cancer cell lines. Lentiviral particles were used to transfect pancreatic cancer cell line a with high expression of FOG2 to reduce FOG2 protein expression. The expression of p-ERK, p-Akt, and Akt was detected by Western blot. The binding of ERK to FOG2 was detected by Co-IP. Results: The expression of FOG2 in pancreatic cancer tissues of 61.1% (66/108) patients was higher than that of corresponding cancers. FOG2 was highly expressed in BxPC3 and PANC1 cells. In control group, inhibition of ERK phosphorylation significantly increased Akt phosphorylation, and activated ERK inhibited Akt activation. After lentivirus transfection decreased FOG2 expression, MAPK inhibitors inhibited ERK activity and p-Akt protein expression did not change significantly. ConclusionThe expression level of FOG2 protein in most pancreatic cancer tissues is higher than that in adjacent tissues. ERK regulates the activation of Akt by binding to FOG2 specifically. Silencing FOG2 can interfere with the inhibition of ERK on Akt signaling pathway. FOG2 regulates MSPK and PI3K signaling pathway strings in pancreatic cancer. Part 3: Effect of silencing FoG2 on the effect of MAPK inhibitors Objective: To study whether silencing FOG2 has any effect on the ability of MAPK inhibitors to inhibit the biological behavior of pancreatic cancer cells.Methods: BxPC3, PANC1 cells stably transfected with lentiviruses were added with MAPK inhibitors, and BxPC3 and PANC1 were measured by Transwell chamber. Flow Cytometry was used to detect the apoptotic ratio of BxPC3 and PANC1 cells, the tumorigenic ability of BxPC3 and PANC1 cells was determined by plate cloning formation assay, and the proliferation of BxPC3 and PANC1 cells was detected by MTT. Results: Transwell assay showed that although FOG2 silencing had no significant effect on the directional migration ability of BxPC3 and PANC1 cells, the sedimentation rate was not significant. The results of flow cytometry and plate cloning showed that silencing FOG2 could enhance the apoptosis-inducing effect of PD98059 on BxPC3, PANC1 cells and inhibit the apoptosis-inducing effect of BxPC3, PANC1 cells, respectively. MTT results showed that PD98059 inhibited the proliferation of BxPC3 and PANC1 cells after FOG2 silencing. CONCLUSION: Silencing FOG2 can increase the sensitivity of pancreatic cancer cells to ERK inhibitors and enhance the inhibition of proliferation, survival, directional migration and colony formation of BxPC3 and PANC1 cells by MAPK inhibitors. Ability.
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.9

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本文編號：2208174