發(fā)布時(shí)間：2018-08-27 14:01

【摘要】：第一部分 14-3-3ξ和aPKC-ι在膽管癌組織中表達(dá)及其與臨床預(yù)后的關(guān)系目的：檢測14-3-3ξ和aPKC-ι在膽管癌組織中的表達(dá),明確二者間的相互關(guān)系,并進(jìn)一步探討二者的表達(dá)與膽管癌臨床病理特征的相關(guān)性。方法：運(yùn)用免疫組織化學(xué)(IHC)、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)和免疫印跡法(WB)的方法檢測64例臨床膽管癌患者的手術(shù)標(biāo)本中14-3-3ξ、aPKC-ι和E-cadherin在癌組織與癌旁組織的差異表達(dá),另外,取10例膽管囊腫組織做陰性對照�？ǚ綑z驗(yàn)和t檢驗(yàn)檢測14-3-3ξ和aPKC-ι與膽管癌病理分化和TNM分期的關(guān)系；Spearman相關(guān)性分析法分析二者之間相關(guān)性；Kaplan-Meier法計(jì)算二者的表達(dá)與膽管癌患者總體生存得關(guān)系；Cox多因素回歸分析分析膽管癌患者預(yù)后獨(dú)立影響因素。結(jié)果：在mRNA和蛋白質(zhì)水平,14-3-3ξ在膽管癌組織中顯著高表達(dá),在癌旁組織和癌旁組織呈低表達(dá)；14-3-3ξ和aPKC-ι在膽管癌組織中協(xié)同高表達(dá),二者呈正相關(guān),并且與E-cadherin表達(dá)相反；14-3-3ξ和aPKC-ι二者的高表達(dá)與膽管癌的病理分化和TNM分期密切相關(guān),二者共同低表達(dá)的患者總體生存時(shí)間較共同高表達(dá)者或單一低表達(dá)者生存時(shí)間長,Cox多因素回歸分析14-3-3ξ是膽管癌預(yù)后的獨(dú)立影響因素。結(jié)論：14-3-3ξ和aPKC-ι協(xié)同促進(jìn)膽管癌的發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移,14-3-3ξ是膽管癌預(yù)后的獨(dú)立影響因素,可作為預(yù)測膽管癌預(yù)后的指標(biāo)。第二部分14-3-3ξ與aPKC-ι結(jié)合并相互調(diào)節(jié)目的：在第一部分研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步明確14-3-3ξ與aPKC-ι之間的相互關(guān)系.方法：通過CO-IP實(shí)驗(yàn)初步檢測14-3-3ξ與aPKC-ι是否存在特異性的直接結(jié)合關(guān)系。并運(yùn)用小分子干擾技術(shù),合成14-3-3ζ-siRNA,aPKC-ι-siRNA和aPKC-ι過表達(dá)載體,構(gòu)建穩(wěn)定的14-3-3ξ低表達(dá).aPKC-ι氏表達(dá)和aPKC-ι高表達(dá)人膽管癌細(xì)胞系。通過qRT-PCR、WB和IF檢測靶向沉默14-3-3ξ或aPKC-ι以及aPKC-ι-siRNA拯救實(shí)驗(yàn)中,相應(yīng)aPKC-ι或14-3-3ξ的表達(dá)情況。結(jié)果：CO-IP結(jié)果提示,經(jīng)14-3-3ξ與aPKC-ι抗體沉淀的人膽管癌組織和細(xì)胞蛋白中,WB可檢測出相應(yīng)的aPKC-ι和14-3-3ξ蛋白條帶；在體外,靶向沉默人膽管癌細(xì)胞中14-3-3ξ或aPKC-ι表達(dá)后,相應(yīng)的出現(xiàn)aPKC-ι或14-3-3ξ表達(dá)下降現(xiàn)象；并且在aPKC-ι-siRNA拯救實(shí)驗(yàn)中,伴隨著aPKC-ι表達(dá)恢復(fù)的同時(shí),14-3-3ξ表達(dá)亦出現(xiàn)升高。結(jié)論：在人膽管癌中,14-3-3ξ與aPKC-ι存在特異性的直接結(jié)合關(guān)系,并且二者通過結(jié)合而互相調(diào)節(jié)。第三部分14-3-3ζ-aPKC-ι復(fù)合物促進(jìn)膽管癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化目的：進(jìn)一步探討14-3-3ξ對人膽管癌細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)化的調(diào)控機(jī)制。方法：通過TGF-β1誘導(dǎo)構(gòu)建人膽管癌細(xì)胞EMT體外模型,并運(yùn)用小分子干擾技術(shù)和siRNA拯救實(shí)驗(yàn),靶向調(diào)控膽管癌14-3-3ξ和aPKC-ι的表達(dá),通過顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變,以及qRT-PCR、WB和IF檢測EMT表型標(biāo)志物。結(jié)果：通過TGF-β1誘導(dǎo)構(gòu)建人膽管癌細(xì)胞EMT體外模型,檢測細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化有短梭形或三角形以及多邊形變?yōu)榧?xì)長的纖維狀或長梭形；EMT標(biāo)志物：上皮樣表型E-cadherin和β-catenin表達(dá)減少,而間質(zhì)樣表型N-cadherin和Vimentin表達(dá)增多；以及transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)化后細(xì)胞侵襲移動能力增強(qiáng)。然后當(dāng)靶向沉默人膽管癌細(xì)胞中14-3-3ξ或aPKC-ι的表達(dá), TGF-β1刺激引起轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)長的纖維狀或長梭形的細(xì)胞數(shù)目減少,EMT標(biāo)志物無明顯變化。另外,aPKC-ι-siRNA拯救實(shí)驗(yàn)提示,伴隨aPKC-ι的表達(dá)恢復(fù),14-3-3ξ的表達(dá)亦得以升高,同時(shí)EMT標(biāo)志物的變化再次出現(xiàn)典型的EMT轉(zhuǎn)化表型標(biāo)志物變化。結(jié)論：在體外,14-3-3ξ通過與aPKC-ι結(jié)合形成復(fù)合物,促進(jìn)人膽管癌細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)化。第四部分靶向沉默14-3-3ξ在體內(nèi)外抑制膽管癌侵襲轉(zhuǎn)移及增殖目的：通過體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證靶向沉默14-3-3ξ對膽管癌增殖和轉(zhuǎn)移的作用。方法：通過Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)和克隆平板實(shí)驗(yàn)體外驗(yàn)證靶向沉默14-3-3ξ對膽管癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移作用；通過裸鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)、肺轉(zhuǎn)移模型的構(gòu)建,并且皮下移植瘤和肺轉(zhuǎn)移瘤行HE染色、IHC染色檢測,以及皮下移植瘤行qRT-PCR和WB檢測,體內(nèi)驗(yàn)證靶向沉默14-3-3ξ對膽管癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移作用。結(jié)果：在體外,靶向沉默14-3-3ξ后,Transwell侵襲試驗(yàn)中膽管癌細(xì)胞穿透基底膜的細(xì)胞數(shù)目減少；劃痕實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞移動的速率下降；克隆平板實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞克隆數(shù)目減少。在體內(nèi),靶向沉默14-3-3ξ后,皮下移植瘤成瘤能力顯著下降；而肺轉(zhuǎn)移瘤的數(shù)目亦顯著減少；經(jīng)IHC、qRT-PCR和WB檢測證實(shí)實(shí)驗(yàn)組中14-3-3ξ和aPKC-ι的表達(dá)下降。結(jié)論：在體內(nèi)、外靶向沉默14-3-3ξ能抑制膽管癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移和增殖,有可能成為膽管癌治療的新靶點(diǎn)。
[Abstract]:Objective: To detect the expression of 14-3-3x2 and aPKC-_in cholangiocarcinoma and their relationship with clinical prognosis. Quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) and immunoblotting (WB) were used to detect the differential expression of 14-3-3, aPKC-_and E-cadherin in the tumor tissues and adjacent tissues of 64 patients with cholangiocarcinoma. In addition, 10 cases of cholangiocyst tissues were taken as negative control. Chi-square test and t-test were used to detect 14-3-3 and aPKC-_and cholangiocarcinoma. Correlation between pathological differentiation and TNM staging was analyzed by Spearman correlation analysis; Kaplan-Meier method was used to calculate the relationship between their expression and overall survival of patients with cholangiocarcinoma; Cox multivariate regression analysis was used to analyze independent prognostic factors in patients with cholangiocarcinoma. The expression of 14-3-3x2 and aPKC-_was positively correlated with the expression of E-cadherin, while the expression of 14-3-3x2 and aPKC-_was correlated with the pathological differentiation and TNM stage of cholangiocarcinoma. Cox multivariate regression analysis showed that 14-3-3_was an independent predictor of the prognosis of cholangiocarcinoma. Conclusion: 14-3-3_and aPKC-_co-promoted the occurrence, development, invasion and metastasis of cholangiocarcinoma, and 14-3-3_was an independent predictor of the prognosis of cholangiocarcinoma. The second part, 14-3-3 zeta and aPKC-_binding and mutual regulation purposes: Based on the first part of the study to further clarify the relationship between 14-3-3 zeta and aPKC-_. Methods: CO-IP experiment was used to detect whether 14-3-3 zeta and aPKC-_had specific direct binding relationship. Small molecule interference technology was used to synthesize 14-3-3 zeta. 3_-siRNA, aPKC-_-siRNA and aPKC-_overexpression vectors were constructed to construct stable 14-3-3_low expression vectors. The expression of aPKC-_and aPKC-_high expression human cholangiocarcinoma cell lines. Targeted silencing 14-3-3_or aPKC-_or aPKC-_-siRNA rescue experiments were performed by qRT-PCR, WB and IF detection. The results suggested that the expression of aPKC-_or 14-3-CO-IP 3_in the corresponding aPKC-_or aPKC-siRNA rescue experiments. WB could detect the corresponding aPKC-_and 14-3-3_protein bands in human cholangiocarcinoma tissues and cell proteins precipitated by 14-3-3_and aPKC-_antibodies; in vitro, the expression of aPKC-_or 14-3-3_decreased after targeted silencing of 14-3-3_or aPKC-_expression in human cholangiocarcinoma cells; and in aPKC-_-siRNA rescue experiment, the expression of aPKC-_-siRNA was accompanied by the decrease of aPKC-_-3-3 The expression of aPKC-_was restored and the expression of 14-3-3 was also elevated. Conclusion: 14-3-3 and aPKC-_were specifically and directly bound to each other in human cholangiocarcinoma. Part 3 14-3-3_-aPKC-_complex promotes epithelial-stromal cell transformation of cholangiocarcinoma cells METHODS: Human cholangiocarcinoma cell EMT model was established by TGF-beta 1 induction, and the expression of 14-3-3 ZE and aPKC-_in cholangiocarcinoma was regulated by small molecule interference technique and siRNA rescue experiment. The morphological changes of cells were observed by microscope, and the phenotype of EMT was detected by qRT-PCR, WB and IF. OBJECTIVE. RESULTS: EMT model of human cholangiocarcinoma cells induced by TGF-beta 1 was established in vitro. The morphological changes of the cells were observed as short spindle or triangle and polygonal shape as slender fibrous or long spindle. EMT markers: epithelioid phenotype E-cadherin and beta-catenin expression decreased, while mesenchymal phenotype N-cadherin and Vimentin expression increased. Then, when the expression of 14-3-3x2 or aPKC-_in human cholangiocarcinoma cells was silenced, the number of cells transformed into slender fibrous or long spindle shape was reduced by TGF-beta 1 stimulation, and the EMT markers did not change significantly. The results showed that the expression of 14-3-3 Zeta increased with the recovery of aPKC-_expression, and the changes of EMT markers appeared again. Conclusion: 14-3-3 Zeta promotes EMT transformation of human cholangiocarcinoma cells in vitro and in vivo by binding to aPKC-_to form a complex. Objective: To verify the effect of targeted silencing 14-3-3x2 on the proliferation and metastasis of cholangiocarcinoma in vitro and in vivo. Methods: Transwell invasion test, scratch test and clone plate test were used to verify the effect of targeted silencing 14-3-3x2 on the proliferation and metastasis of cholangiocarcinoma cells in vitro and subcutaneous transplantation of tumor in nude mice. In vivo, the proliferation and metastasis of cholangiocarcinoma cells were tested by targeting silencing 14-3-3x2. Results: In vitro, after targeting silencing 14-3-3x2, cholangiocarcinoma cells penetrated in the Transwell invasion test. The number of transbasement membrane cells decreased; the rate of cell migration decreased in scratch test; and the number of cell clones decreased in clone plate test. Conclusion: Targeted silencing of 14-3-3_in vitro can inhibit the invasion, metastasis and proliferation of cholangiocarcinoma cells, and may become a new target for the treatment of cholangiocarcinoma.
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.8

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本文編號：2207506