發(fā)布時間：2018-08-26 14:23

【摘要】：卵巢癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一,也是死亡率最高的女性生殖系統(tǒng)腫瘤。根據(jù)WHO組織學(xué)分型,上皮性卵巢癌(epithelia ovarian cancer,EOC)是卵巢癌中最多見的組織學(xué)類型,EOC的標(biāo)準(zhǔn)治療方案為“初次理想的腫瘤細胞減滅術(shù)+以鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療”,臨床工作中我們發(fā)現(xiàn)盡管化療是其最重要的輔助治療手段,但很多患者在治療過程中出現(xiàn)原發(fā)或繼發(fā)性化療耐藥,使化療效果不理想,復(fù)發(fā)率和死亡率居高不下,因此對卵巢癌轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及耐藥過程中參與的生物分子的研究已成為卵巢癌研究熱點。通過對卵巢癌生物學(xué)和代謝機制的探索,期望找出卵巢癌分子靶向治療的有效靶點已成為目前卵巢癌研究的重要課題。研究發(fā)現(xiàn),miRNA在細胞的調(diào)控方面具有重要作用,一方面miRNA通過控制癌細胞的啟動,調(diào)控癌細胞的增殖、侵襲和凋亡;另一方面作為與卵巢癌細胞耐藥密切相關(guān)的信號通路的上游或下游的效應(yīng)因子,miRNA可以促進或抑制腫瘤細胞的凋亡從而提高或降低卵巢癌細胞的化療敏感性。通過查閱大量文獻發(fā)現(xiàn)miR-199a-3p在多種癌癥中異常表達,如肝癌、前列腺癌或乳腺癌等,但是miR-199a在卵巢癌中作用的研究報道并不多見。在前期工作中我們通過芯片篩選并PCR驗證發(fā)現(xiàn)miR-199a-3p在鉑類耐藥的卵巢癌細胞中表達水平下調(diào),明顯低于鉑類敏感細胞中的表達水平,提示miR-199a-3p可能在維持或調(diào)節(jié)卵巢癌生物學(xué)行為中發(fā)揮重要作用。miR-199a-3p在卵巢癌細胞中的差異表達具有何種意義?miR-199a-3p對卵巢癌生物學(xué)行為有何影響?miR-199a-3p在卵巢癌細胞復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和耐藥中發(fā)揮作用的調(diào)控機制是什么?為了回答上述問題,本研究選擇miR-199a-3p作為卵巢癌發(fā)展和耐藥的研究靶點。通過臨床、細胞及活體不同水平的研究,初步探討miR-199a-3p在上皮性卵巢癌中的臨床意義及miR-199a-3p在EOC的發(fā)展及鉑類化療耐藥中的作用和可能調(diào)控機制。整合素是細胞表面粘附分子的一種,由α和β兩個次級別單位通過非共價鍵連接形成的細胞跨膜蛋白,胞外連接基質(zhì)蛋白或相鄰細胞,胞內(nèi)連接細胞骨架系統(tǒng),從而構(gòu)成腫瘤細胞賴以生存發(fā)展的空間紐帶;另一方面,整合素作為受體可與多種細胞因子結(jié)合,從而向細胞內(nèi)外雙向傳導(dǎo)生物信息,構(gòu)成腫瘤細胞感受外界刺激并做出相應(yīng)反應(yīng)的的信息樞紐。近年研究發(fā)現(xiàn)整合素表達于惡性腫瘤表面,并在腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和化療耐藥中表達上調(diào),整合素可能參與了腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移和化療藥物誘導(dǎo)的腫瘤細胞凋亡過程。利用生物信息分析軟件預(yù)測及雙熒光素酶報告基因驗證miR-199a-3p在卵巢癌中的靶基因為ITGB8(Integrinβ8,整合素β8),通過進一步實驗證明miR-199a-3p對ITGB8的靶向調(diào)控在EOC發(fā)展及鉑類耐藥中發(fā)揮的作用,初步探討miR-199a-3p/ITGB8信號通路參與EOC發(fā)展及鉑類耐藥的機制。目前,關(guān)于miR-199a-3p通過ITGB8參與EOC發(fā)展及鉑類耐藥的機制尚無報道,本研究將為miR-199a-3p在EOC發(fā)展及鉑類耐藥中的作用提供有力的直接證據(jù)。研究目的研究miR-199a-3p在EOC中的臨床意義及miR-199a-3p通過靶向調(diào)控ITGB8對卵巢癌細胞生物學(xué)行為的影響。初步探討miR-199a-3p在EOC的發(fā)展和鉑類耐藥中的作用和分子機制,為控制EOC的發(fā)展和化療耐藥提供候選靶點和理論支持。研究方法1.以正常卵巢組織、良性及交界性卵巢腫瘤及EOC鉑類耐藥和鉑類敏感病例的病理切片及臨床資料為研究對象,q RT-PCR法對不同組別miR-199a-3p表達水平進行檢測,統(tǒng)計分析miR-199a-3p基因表達差異與EOC臨床病理因素、鉑類耐藥的相關(guān)性;2.選取卵巢癌親本株SKOV3細胞進行細胞培養(yǎng),并通過濃度遞增的方法構(gòu)建SKOV3/DDP(SKOV3順鉑耐藥細胞)細胞株,通過MTT、Transwell和Wound healing方法檢測SKOV3/DDP及SKOV3在細胞耐藥指數(shù)、遷移和侵襲等方面的生物學(xué)效能,通過q RT-PCR方法檢測SKOV3和SKOV3/DDP中miR-199a-3p表達水平的差異;3.脂質(zhì)體法用miR-199a-3p mimic和miR-199a-3p inhibitor分別轉(zhuǎn)染SKOV3/DDP及SKOV3細胞,通過MTT、Transwell和Wound healing方法檢測轉(zhuǎn)染后SKOV3/DDP及SKOV3細胞耐藥指數(shù)、遷移、侵襲能力和細胞凋亡的變化,初步分析miR-199a-3p對卵巢癌細胞生物學(xué)行為的影響;4.利用生物信息分析軟件預(yù)測并查閱文獻總結(jié)miR-199a-3p可能靶基因,q RT-PCR和WB方法檢測SKOV3/DDP及SKOV3細胞中可能靶基因m RNA表達水平和蛋白表達水平;綜合分析ITGB8是miR-199a-3p的可能靶基因;5.通過脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染miR-199a-3p mimic和miR-199a-3p inhibitor后檢測SKOV3/DDP及SKOV3細胞中ITGB8表達的變化進一步驗證miR-199a-3p對ITGB8的靶向調(diào)控作用;6.通過雙熒光素酶報告基因驗證證實ITGB8是miR-199a-3p的靶基因,并確定了miR-199a-3p與ITGB8的結(jié)合位點;7.利用重組質(zhì)粒技術(shù)構(gòu)建ITGB8過表達載體:在NCBI網(wǎng)站查找ITGB8基因序列,找出ITGB8的ORF,根據(jù)pc DNA3.1的載體圖譜選擇合適的酶切位點,設(shè)計引物,通過PCR的方式克隆目的基因,被消化后插入pc DNA3.1,構(gòu)建pc DNA3.1-ITGB8重組質(zhì)粒;8.通過脂質(zhì)體法用miR-199a-3pmimic、inhibitor和(或)pc DNA3.1-ITGB8分別轉(zhuǎn)染卵巢癌SKOV3/DDP及SKOV3細胞,分析miR-199a-3p通過靶向調(diào)控ITGB8對卵巢癌細胞生物學(xué)行為的影響;9.MTT法檢測不同轉(zhuǎn)染組對順鉑的化療敏感性;Transwell檢測不同轉(zhuǎn)染組細胞侵襲能力;劃痕實驗檢測不同轉(zhuǎn)染組細胞遷移能力,分析miR-199a-3p通過靶向調(diào)控ITGB8對卵巢癌細胞化療耐藥、侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響。10.流式細胞術(shù)檢測各個轉(zhuǎn)染組的細胞周期和凋亡的變化,分析miR-199a-3p通過靶向調(diào)控ITGB8對卵巢癌細胞增殖和凋亡的作用。11.構(gòu)建卵巢癌原位異種模型:分別注射SKOV3和SKOV3/DDP細胞懸液于裸鼠卵巢包膜下,成瘤后比較卵巢原位移植瘤大小、重量及腹腔轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)目等。12.通過q RT-PCR方法檢測分別注射SKOV3和SKOV3/DDP細胞后成瘤的卵巢原位移植瘤組織標(biāo)本中miR-199a-3p表達水平。13.通過q RT-PCR和Westen-Blot方法檢測注射SKOV3和SKOV3/DDP細胞后成瘤的卵巢原位移植瘤組織標(biāo)本中ITGB8的m RNA表達水平和蛋白表達量。研究結(jié)果1.miR-199a-3p在EOC中的臨床意義及其與鉑類耐藥的關(guān)系(1)與正常卵巢組織相比,miR-199a-3p的表達在卵巢良性上皮性腫瘤中無明顯差異,卵巢交界性腫瘤中輕微下降,而EOC中明顯下降;(2)相對于EOC鉑類敏感組織,耐藥組織中miR-199a-3p的相對表達水平明顯下降,提示miR-199a-3p與EOC的耐藥有相關(guān)性;(3)根據(jù)手術(shù)病理分期,隨著卵巢癌期別增加,miR-199a-3p的表達逐漸減少;不同組織學(xué)分級中,分化程度越差,miR-199a-3p的表達水平越低;在有無合并淋巴轉(zhuǎn)移中,伴淋巴轉(zhuǎn)移者較無淋巴轉(zhuǎn)移者miR-199a-3p的表達明顯減低;不同組織學(xué)類型miR-199a-3p的表達未見明顯差異。說明miR-199a-3p的表達水平與EOC分期、分化程度及淋巴有無轉(zhuǎn)移等臨床特征具有相關(guān)性,隨著EOC分期和惡性程度的升高,miR-199a-3p表達水平呈逐漸下降趨勢,miR-199a-3p與EOC的發(fā)展相關(guān)。2.miR-199a-3p在卵巢癌細胞中的表達及其對卵巢癌細胞生物學(xué)行為的影響(1)培養(yǎng)并構(gòu)建卵巢癌順鉑耐藥細胞系SKOV3/DDP,在細胞化療耐藥、遷移和侵襲等生物學(xué)效能方面,SKOV3/DDP細胞均明顯強于SKOV3細胞;(2)SKOV3/DDP細胞中miR-199a-表達水平明顯低于SKOV3細胞;(3)上調(diào)miR-199a-3p的表達,SKOV3/DDP細胞對順鉑的耐藥性下降,敏感性增加,顯著促進順鉑介導(dǎo)的凋亡,抑制癌細胞生長、遷移和侵襲能力;下調(diào)miR-199a-3p的表達,SKOV3細胞對順鉑的敏感性下降,耐藥性增加,顯著抑制順鉑介導(dǎo)的凋亡,增強癌細胞生長、遷移和侵襲能力;提示miR-199a-3p在EOC中具有抑癌基因的作用,抑制卵巢癌細胞的生長、侵襲和遷移,促進卵巢癌細胞的凋亡,并增加卵巢癌細胞對順鉑的化療敏感性;3.miR-199a-3p靶向調(diào)控ITGB8(1)生物信息分析及文獻總結(jié)miR-199a-3p的可能靶基因,q RT-PCR和WB方法檢測SKOV3/DDP及SKOV3中這些可能靶基因m RNA表達水平和蛋白表達水平,在這些可能靶基因中ITGB8表達及變化顯著;(2)利用生物信息功能分析miR-199a-3p靶基因中ITGB8與miR-199a-3p關(guān)聯(lián)性強,而整合素與卵巢癌的發(fā)展和化療耐藥相關(guān);(3)miR-199a-3p表達下調(diào)時,ITGB8蛋白表達水平升高;miR-199a-3p表達上調(diào)則顯著抑制ITGB8蛋白表達水平,miR-199a-3p對ITGB8呈負向調(diào)控作用。(4)雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實miR-199a-3p直接靶向調(diào)控ITGB8,ITGB8-3’UTR-2是miR199a-3p和ITGB8的靶結(jié)合位點;4.miR-199a-3p通過直接靶向調(diào)控ITGB8影響卵巢癌細胞生物學(xué)行為(1)構(gòu)建pc DNA3.1-ITGB8重組質(zhì)粒,過表達ITGB8;(2)下調(diào)miR-199a-3p或上調(diào)ITGB8時,卵巢癌細胞對順鉑的敏感性降低,耐藥性增加,同時下調(diào)miR-199a-3p并上調(diào)ITGB8時卵巢癌細胞對順鉑的敏感性進一步降低,耐藥性進一步增加,說明下調(diào)miR-199a-3p可以增強ITGB8的作用;另一方面,當(dāng)miR-199a-3p表達上調(diào),細胞對順鉑敏感性增加,耐藥性減低,同時上調(diào)miR-199a-3p和ITGB8時,ITGB8的作用被抑制,說明下調(diào)miR-199a-3p可以抑制ITGB8的作用。(3)ITGB8表達上調(diào)時,SKOV3細胞的遷移和侵襲能力增加,下調(diào)miR-199a-3p可以增強ITGB8的這一作用;上調(diào)miR-199a-3p則降低ITGB8的這一作用。(4)流式細胞技術(shù)檢測不同轉(zhuǎn)染組細胞周期和細胞凋亡率顯示:上調(diào)ITGB8的表達可以顯著抑制細胞增殖和順鉑介導(dǎo)的凋亡,下調(diào)miR-199a-3p可以增強ITGB8的這一作用;上調(diào)miR-199a-3p則降低ITGB8的這一作用。(5)構(gòu)建卵巢癌原位異種模型,與注射SKOV3組小鼠模型相比,SKOV3/DDP組裸鼠模型形成較多的腹腔轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié),卵巢原位腫瘤的體積更大,重量更重;腫瘤組織內(nèi)miR-199a-3p的表達水平明顯降低,ITGB8 m RNA表達水平和蛋白含量明顯升高。結(jié)論1.miR-199a-3p的表達隨EOC惡性程度及分期的升高而下降,并在鉑類耐藥組織中表達水平下降,說明miR-199a-3p與EOC的發(fā)展和鉑類耐藥相關(guān);2.miR-199a-3p通過直接靶向作用負向調(diào)控ITGB8,促進癌細胞凋亡,增強卵巢癌細胞對順鉑的化療敏感性;3.miR-199a-3p通過直接靶向作用負向調(diào)控ITGB8抑制卵巢癌細胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移;4.在動物模型內(nèi),與卵巢癌親本細胞相比,卵巢癌順鉑耐藥細胞原位成瘤能力及轉(zhuǎn)移能力更強,其原位腫瘤組織內(nèi)miR-199a-3p的表達水平下降,ITGB8的表達增加;5.miR-199a-3p/ITGB8信號通路在EOC發(fā)展和鉑類化療耐藥中發(fā)揮了抑癌基因的作用。當(dāng)miR-199a-3p表達下調(diào),通過上調(diào)靶基因ITGB8的表達,增加卵巢癌細胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移,從而促進卵巢癌的發(fā)展;同時使癌細胞的凋亡減少,通過卵巢癌鉑類耐藥中的靶后機制導(dǎo)致化療耐藥,miR-199a-3p有望成為卵巢癌靶向治療的新的生物分子。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R737.31
，

本文編號：2205140