發(fā)布時(shí)間：2018-02-02 02:46

  本文關(guān)鍵詞： 胃癌 幽門(mén)螺旋桿菌 CagA KLF4 TET1　出處：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：胃癌是起源于胃粘膜上皮的惡性腫瘤,最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,即使有先進(jìn)的腫瘤切除術(shù)和分子靶向療法,但是胃癌的預(yù)后很差,其病死率在腫瘤相關(guān)疾病中排列第二。胃癌的發(fā)病率在地理上是不同的,亞洲東部、中部、東部歐洲、中美洲和南美洲是高發(fā)地區(qū)。胃癌發(fā)生的原因至今并未明確,幽門(mén)螺旋桿菌感染、高鹽飲食、抽煙等已經(jīng)被證實(shí)與胃癌的發(fā)生密切相關(guān),其中幽門(mén)螺旋桿菌感染的作用最為顯著。幽門(mén)螺旋桿菌感染與多種胃腸疾病有關(guān),包括無(wú)癥狀性胃炎、胃潰瘍和胃癌。全球約有一半的人均有幽門(mén)螺旋桿菌感染,但是只有約1~3%的人會(huì)發(fā)展為胃癌,這也使得幽門(mén)螺旋桿菌感染成為胃癌最常見(jiàn)的病因。Cag A是幽門(mén)螺旋桿菌最重要的毒力致病因子,其在幽門(mén)螺旋桿菌感染引發(fā)胃癌的病理過(guò)程中起到重要的作用。Cag A在幽門(mén)螺旋桿菌體內(nèi)通過(guò)其T4SS系統(tǒng)直接進(jìn)入胃粘膜細(xì)胞,進(jìn)入細(xì)胞后結(jié)合并且異常調(diào)節(jié)一系列細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路分子,引起細(xì)胞形態(tài)改變,如細(xì)胞分散、細(xì)胞延長(zhǎng)、細(xì)胞伸展。另一方面,Cag A可以引起細(xì)胞內(nèi)的腫瘤抑癌基因表達(dá)降低或者丟失,如P53,RUNX3,GKN1等,進(jìn)而加速胃癌的發(fā)生和進(jìn)程。那么,Cag A會(huì)不會(huì)對(duì)其它腫瘤抑癌基因的表達(dá)也有抑制作用呢?KLF4是一個(gè)含有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子,主要在終末分化的上皮細(xì)胞中高表達(dá),如皮膚、肺、胃腸道等。KLF4能夠抑制細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞分化,并且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在胃癌中KLF4發(fā)揮著抑癌基因的作用,和正常的胃粘膜細(xì)胞相比胃癌組織中其蛋白表達(dá)是明顯降低的。所以,我們猜想Cag A會(huì)不會(huì)參與KLF4在胃癌中低表達(dá)的分子過(guò)程?在我們前期的研究中已經(jīng)證實(shí)KLF4的啟動(dòng)子發(fā)生了甲基化是導(dǎo)致其表達(dá)降低的一個(gè)重要原因。而且大量的流行病學(xué)和臨床數(shù)據(jù)證實(shí),幽門(mén)螺旋桿菌感染可以增加細(xì)胞基因組的甲基化水平,從而參與胃癌的發(fā)生以及發(fā)展。為此,我們推測(cè):幽門(mén)螺旋桿菌感染/Cag A可能通過(guò)甲基化途徑引起KLF4啟動(dòng)子的甲基化,進(jìn)而導(dǎo)致其在胃癌中的低表達(dá),最終促進(jìn)了胃癌的發(fā)生發(fā)展呢?為驗(yàn)證假說(shuō),我們首先檢測(cè)正常胃上皮細(xì)胞和胃癌細(xì)胞株中KLF4的基礎(chǔ)表達(dá)情況,然后將低表達(dá)KLF4的胃癌細(xì)胞株轉(zhuǎn)染外源性Cag A表達(dá)質(zhì)粒,檢測(cè)KLF4的表達(dá)變化,再檢測(cè)細(xì)胞行為學(xué)行為的變化情況,并進(jìn)一步探索Cag A與KLF4之間的具體分子機(jī)制關(guān)系。研究方法1.WB檢測(cè)一株正常胃上皮細(xì)胞和三株胃癌細(xì)胞的KLF4的基礎(chǔ)表達(dá)水平;將高表達(dá)KLF4蛋白的GES-1胃上皮細(xì)胞和一株AGS胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染Cag A質(zhì)粒后,用WB和RT-PCR方法檢測(cè)KLF4的表達(dá)情況及其行為學(xué)變化:(1)MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力;(2)平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的克隆形成能力;(3)Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力。2.用CRISPR/Cas9方法建立敲低KLF4的穩(wěn)定細(xì)胞株GES-1,檢測(cè)其行為學(xué)變化。3.WB檢測(cè)一株正常胃上皮細(xì)胞和三株胃癌細(xì)胞的TET1的基礎(chǔ)表達(dá)水平;將高表達(dá)KLF4的GES-1胃上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染Cag A質(zhì)粒后,WB和RT-PCR方法檢測(cè)TET1的表達(dá)情況;用CRISPR/Cas9方法建立敲低TET1的穩(wěn)定細(xì)胞系GES-1,WB方法檢測(cè)KLF4的表達(dá)情況。4.將低表達(dá)KLF4的胃癌細(xì)胞株轉(zhuǎn)染TET1質(zhì)粒過(guò)表達(dá)后,RT-PCR方法檢測(cè)KLF4的表達(dá)情況以及行為學(xué)變化:Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其遷移能力。5.收集88例臨床胃癌病人資料和病理標(biāo)本,臨床數(shù)據(jù)分析幽門(mén)螺旋桿菌與胃癌相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性;免疫組化檢測(cè)在胃癌組織中幽門(mén)螺旋桿菌感染與KLF4和5hmc的相關(guān)性。研究結(jié)果1.KLF4在胃癌細(xì)胞中是低表達(dá)的;2.在正常胃上皮GES-1細(xì)胞和AGS細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Cag A質(zhì)粒后KLF4的表達(dá)下降,且細(xì)胞的增殖能力明顯上升,平板克隆形成能力也明顯上升,細(xì)胞遷移能力明顯增強(qiáng);3.穩(wěn)定敲低KLF4的GES-1細(xì)胞與未處理GES-1細(xì)胞相比,其增殖能力,克隆形成能力和遷移能力也明顯增強(qiáng);4.TET1在胃癌細(xì)胞中是低表達(dá)的,正常胃上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染Cag A后TET1表達(dá)降低;穩(wěn)定敲低TET1的GES-1細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)KLF4的蛋白表達(dá)也明顯降低;在胃癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)TET1后KLF4的表達(dá)升高,且細(xì)胞的遷移能力也明顯降低;5.臨床數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示,幽門(mén)螺旋桿菌感染與胃癌的組織分化和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性;免疫組化結(jié)果顯示,KLF4和5hmc在癌旁組織、無(wú)幽門(mén)螺旋桿菌感染的胃癌組織、有幽門(mén)螺旋桿菌感染的胃癌組織中表達(dá)依次降低,這也表明幽門(mén)螺旋桿菌感染與胃癌組織中的KLF4和5hmc表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論1.Cag A的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染降低了KLF4的表達(dá),促進(jìn)了胃上皮GES-1細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和胃癌細(xì)胞的惡性行為學(xué)改變。2.Cag A的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染降低了TET1的表達(dá),而TET1表達(dá)的降低可能與增加KLF4啟動(dòng)子甲基化水平有關(guān)。3.KLF4和5hmc在幽門(mén)螺旋桿菌感染的胃癌細(xì)胞中表達(dá)低于幽門(mén)螺旋桿菌未感染的胃癌組織中。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R735.2

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本文編號(hào)：1483448