發(fā)布時(shí)間：2018-02-01 20:59

  本文關(guān)鍵詞： 前列腺癌 Exosomes microRNA 生物標(biāo)志物　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：前列腺癌是男性泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤,但目前缺乏敏感性和特異性俱佳的生物標(biāo)志物,尋找一種理想的腫瘤生物標(biāo)志物是當(dāng)前前列腺癌臨床和基礎(chǔ)研究中備受關(guān)注的課題。Exosomes是細(xì)胞分泌到循環(huán)血液和體液中的一類包含特定蛋白質(zhì)、m RNA和micro RNA(mi RNA)等信號(hào)分子的小囊泡。最新研究表明,mi RNA能夠被主動(dòng)選擇性地包裹進(jìn)Exosomes,并參與細(xì)胞間信息傳遞及通訊,其表達(dá)變化可以特異地反映機(jī)體某些生理病理狀態(tài)的動(dòng)態(tài)變化和轉(zhuǎn)歸,在腫瘤發(fā)生發(fā)展中有望成為良好的腫瘤特異性分子標(biāo)志物,而且循環(huán)血液和體液中Exosomes的相關(guān)檢測(cè)具備無(wú)創(chuàng)、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。因此,體液中的Exosomal mi RNA分子標(biāo)志物在腫瘤臨床診斷和預(yù)后評(píng)估等方面具有良好的應(yīng)用前景。基于此,為了探討Exosomal mi RNA在前列腺癌臨床診斷中的作用,我們進(jìn)行了以下三部分研究:第一部分前列腺癌血清Exosomes的分離、鑒定及其生物學(xué)特性目的:建立穩(wěn)定的血清Exosomes分離方法并進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子表型鑒定,探討前列腺癌Exosomes的生物學(xué)特性。方法:采用Exo Quick沉淀試劑分離血清Exosomes,用透射電鏡和Nano Sight分析儀,以及Western blot和流式細(xì)胞術(shù)分別進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子表型鑒定。將來(lái)自前列腺癌患者混合血清的Exosomes與正�；|(zhì)細(xì)胞WPMY-1共培養(yǎng),用激光共聚焦顯微鏡觀察前列腺癌Exosomes在受體細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn);分別采用CCK-8法、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)前列腺癌血清Exosomes對(duì)WPMY-1細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力的影響。結(jié)果:1、血清Exosomes的提取和鑒定:采用Exo Quick從人血清中分離到的沉淀物,顆粒直徑約為30~100nm,最大分布峰值為58nm,能夠表達(dá)特征性蛋白HSP70和CD63,符合Exosomes的主要特征。2、前列腺癌血清Exosomes的生物學(xué)特性:經(jīng)過(guò)24h共培養(yǎng),激光共聚焦顯微鏡觀察到前列腺癌血清Exosomes能夠穿過(guò)細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)到受體細(xì)胞中,且轉(zhuǎn)運(yùn)量與Exosomes的初始濃度相關(guān);前列腺癌血清Exosomes可以使正常前列腺基質(zhì)細(xì)胞WPMY-1的增殖能力顯著提高,且與作用時(shí)間和Exosomes的作用濃度成正比;此外,前列腺癌Exosomes能夠促使正常基質(zhì)細(xì)胞的侵襲能力和遷移能力顯著增強(qiáng)。結(jié)論:采用Exo Quick沉淀試劑從血清中可以穩(wěn)定分離出Exosomes,前列腺癌血清Exosomes能促使正常基質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出顯著的增殖、侵襲和遷移能力,提示其可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切,很有必要進(jìn)一步探討其在腫瘤臨床診療中的價(jià)值。第二部分Exosomal mi RNA檢測(cè)在前列腺癌診斷中的價(jià)值目的:研究Exosomes在前列腺癌循環(huán)mi RNA檢測(cè)中的價(jià)值。方法:采用Exo Quick沉淀試劑分離Exosomes,提取RNA,并用Agilent 2200生物分析儀進(jìn)行質(zhì)量分析。采用q RT-PCR法檢測(cè)mi RNA的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果:1、Exosomal RNA的分布及其特點(diǎn):Agilent 2200生物分析儀檢測(cè)結(jié)果提示血清Exosomes中富含小RNA。10例健康人群血清Exosomes中均可檢出4種常見(jiàn)mi RNA(mi R-21,mi R-16,mi R-20a和let-7a),且其相對(duì)表達(dá)量顯著高于全血清樣本和去除Exosome后的上清液。2、Exosomes在前列腺癌血清循環(huán)mi RNA檢測(cè)中的價(jià)值:血清Exosomes中的mi R-141表達(dá)水平顯著高于血清游離mi R-141,且二者顯著相關(guān),PCa組的Exosomal mi R-141含量顯著高于BPH組和正常對(duì)照人群;q RT-PCR檢測(cè)51例PCa患者和40例正常對(duì)照人群的血清Exosomal mi R-141表達(dá)水平,結(jié)果表明PCa組的Exosomal mi R-141表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照組(P0.0001),且與腫瘤臨床病理特征有不同程度的相關(guān)性。采用Exosomal mi R-141判斷轉(zhuǎn)移性前列腺癌的ROC曲線下面積(AUC)為0.8694,檢測(cè)敏感性和特異性分別為80%和87.10%。3、前列腺癌患者尿液Exosomal mi RNA的初步檢測(cè):在血清學(xué)研究的基礎(chǔ)上,我們對(duì)10例前列腺癌患者的尿液樣本進(jìn)行了探索性研究。結(jié)果顯示,所有患者尿液Exosomes樣本中均可不同程度地檢出mi R-141,但總體表達(dá)水平與對(duì)照組之間未見(jiàn)顯著性差異(P=0.0992)。結(jié)論:分離血清Exosomes有利于提高某些循環(huán)mi RNA的檢測(cè)敏感性,尿液Exosomes中也可以檢測(cè)到mi RNA,這就為前列腺癌Exosomal mi RNA標(biāo)志物的研究提供了新的思路和可能性。第三部分前列腺癌尿液Exosomal mi RNA差異表達(dá)譜的測(cè)序篩選目的:測(cè)序篩選前列腺癌患者尿液Exosomal mi RNA差異表達(dá)譜。方法:選取轉(zhuǎn)移性前列腺癌、局限性前列腺癌和健康男性各3例,留取晨尿。采用Exo Quick-TC沉淀試劑分離尿液Exosomes,提取RNA并采用Agilent 2200生物分析儀進(jìn)行質(zhì)檢,構(gòu)建c DNA文庫(kù),采用Illumina Hi SeqTM 2500平臺(tái)進(jìn)行小RNA序列測(cè)定。將測(cè)序數(shù)據(jù)與mi RBase21.0數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),計(jì)算各樣本的mi RNA表達(dá)量并進(jìn)行組間差異分析,篩選出前列腺癌的尿液Exosomal mi RNA差異表達(dá)譜。對(duì)存在顯著性差異的基因進(jìn)行q RT-PCR初步驗(yàn)證。結(jié)果:經(jīng)過(guò)深度測(cè)序,尿液Exosomes中mi RNA的平均含量為(8.10±0.03)%,各樣本間未見(jiàn)顯著差異。通過(guò)組間比對(duì),發(fā)現(xiàn)Exosomal mi R-375差異最為顯著,在正常對(duì)照、局限癌和轉(zhuǎn)移癌組中呈漸進(jìn)性低表達(dá),采用20例前列腺癌尿液樣本對(duì)其進(jìn)行q RT-PCR初步驗(yàn)證,所得結(jié)果與測(cè)序一致。此外,另有22個(gè)mi RNA在前列腺癌中出現(xiàn)差異表達(dá),其中10個(gè)呈漸進(jìn)性低表達(dá)(mi R-664a-5p,mi R-200b-5p,mi R-30a-5p,mi R-30a-3p,mi R-200c-3p,mi R-151a-3p,mi R-532-5p,mi R-361-3p,mi R-30d-5p,mi R-148-3p),12個(gè)呈漸進(jìn)性高表達(dá)(mi R-126-5p,mi R-3656,mi R-199a-5p,mi R-4508,mi R-9-5p,mi R-1-3p,mi R-126-3p,mi R-199a-3p,mi R-4497,mi R-1273g-3p,mi R-4532,mi R-3960)。結(jié)論:通過(guò)深度測(cè)序,初步篩選出包括mi R-375在內(nèi)的23個(gè)差異表達(dá)基因,為進(jìn)一步驗(yàn)證和研究前列腺癌尿液Exosomal mi RNA表達(dá)譜奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.25

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本文編號(hào)：1482863