發(fā)布時間：2018-01-31 20:47

  本文關(guān)鍵詞： MCU PGC-1α 細胞凋亡 ROS 帕金森　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景帕金森病(Parkinson's disease, PD)是一種常見的中老年人神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病,它以黑質(zhì)致密部(SNpc)多巴胺能(DA)神經(jīng)元的選擇性丟失為特點,臨床癥狀包括肌肉強直、靜止性震顫、運動遲緩和姿態(tài)不穩(wěn)等。帕金森病具有嚴重持續(xù)進展性、致殘性以及目前治療上的“無法治愈性”,嚴重威脅著人類的生命健康和生存質(zhì)量。迄今為止,人們尚未完全了解帕金森的發(fā)病機制,也還沒有確切可靠的藥物根治帕金森病。越來越多的體外、體內(nèi)及人體實驗研究指出細胞凋亡與帕金森病密切相關(guān)。因此,闡明帕金森病與細胞凋亡間的聯(lián)系,阻止神經(jīng)元細胞凋亡,從而減慢或阻止帕金森病進程顯得尤為重要。PC12細胞是大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤分化細胞株,具有多巴胺神經(jīng)元的特征,已被廣泛用做PD研究的神經(jīng)元模型細胞。MPP+作用于PC12細胞可誘導(dǎo)PD模型的形成,已被廣泛地運用于PD的實驗研究。50年代科學(xué)家使用電子顯微鏡觀察了一位PD患者中腦的黑質(zhì)部位,發(fā)現(xiàn)在黑質(zhì)部位出現(xiàn)了一些類似凋亡的高密度的細胞核聚集特征。Mochizuki通過末端酶標(biāo)記法(TUNEL)檢測發(fā)現(xiàn),黑質(zhì)部位的多巴胺能神經(jīng)細胞有0.6%-4.8%發(fā)生凋亡。顯示帕金森與中腦多巴胺能神經(jīng)元凋亡有密切關(guān)系。1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+)可引起帕金森病的癥狀,故被廣泛用來建立帕金森病細胞模型和動物模型,對帕金森的發(fā)病機制進行研究。目前研究表明,MPP+作為一種外源性毒物引起帕金森的機制是通過氧化應(yīng)激機制和抑制線粒體電子呼吸鏈的復(fù)合體的活性,最終導(dǎo)致多巴胺神經(jīng)元凋亡。作為第二信使的Ca2+在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要作用,研究顯示,無論是在早期還是晚期細胞內(nèi)鈣離子濃度升高都有促進細胞凋亡的作用。正常情況下,細胞質(zhì)中的Ca2+濃度很低,而細胞外、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Ca2+濃度要比細胞質(zhì)中高,因而胞內(nèi)Ca2+庫的Ca2+釋放和胞外Ca2+內(nèi)流均能使細胞質(zhì)內(nèi)的Ca2+濃度大幅度增高,從而激活Ca2+依賴性激酶,引起一系列生化反應(yīng)。線粒體是細胞鈣的緩沖器,具有攝取、釋放Ca2+以及調(diào)節(jié)胞漿Ca2+濃度的能力。線粒體通過位于線粒體內(nèi)膜上低親和力、高選擇性的離子通道線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運體MCU攝取Ca2+MCU定位于線粒體內(nèi)膜,由MICUl(調(diào)節(jié)伴侶)和MCU(成孔亞基)組成。盡管MCU與Ca2+親和力低,但當(dāng)細胞受到刺激時,線粒體的基質(zhì)Ca2+濃度能([Ca2+]mt)迅速改變,這是由于線粒體與ER或質(zhì)膜上的Ca2+通道相鄰,線粒體低親和力的攝鈣系統(tǒng)暴露于高Ca2+濃度的微域,從而有利于線粒體的鈣攝入。過氧化物酶增殖物激活受體γ(PPAR γ)輔激活因子la (PGC-1α)是一種功能強大的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,可強有力調(diào)控氧化和抗氧化過程,在線粒體生物學(xué)過程和氧化應(yīng)激中具有突出的作用,其廣泛參與各種新陳代謝通路的調(diào)節(jié),如能量代謝、線粒體生物合成、糖脂代謝等。在MPTP小鼠模型上,過表達PGC-la能保護多巴胺神經(jīng)元免于MPTP導(dǎo)致的毒性作用。PGC-1α敲除小鼠,對低劑量MPTP處理比野生型小鼠更加敏感,有神經(jīng)變性的損害。PGC-1α、MCU是否在MPP+誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡中發(fā)揮作用,以及具體的作用、機制如何,尚未見文獻報道。因此,本研究主要探討PGC-1α、MCU是否參與MPP+誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡,以及它在其中扮演何種角色,為今后開發(fā)帕金森病的治療藥物提供理論依據(jù)。目的探索MPP+誘導(dǎo)的PC12細胞的凋亡的機制;明確PGC-1α、MCU是否參與MPP+誘導(dǎo)的PC12細胞的凋亡；探討MCU通過何種機制參與MPP+誘導(dǎo)的PC12細胞的凋亡；改變PGC-1α表達對MPP+誘導(dǎo)細胞凋亡率的影響；ROS在MPP+致凋亡中的作用。方法1、在37℃培養(yǎng)箱(5%CO2、95%空氣)內(nèi)培養(yǎng)大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤細胞(PC12)細胞,取對數(shù)生長期細胞。分別用不同濃度的MPP+(0mM、0.5mM、 1mM、2mM、4mM)處理PC12細胞不同時間(24h、28h)后,MTT法檢測細胞活力,觀察不同濃度MPP+干預(yù)PC12細胞后的細胞活力變化。2、1mM　MPP+處理PC12細胞24h后,使用Hoechst法、流式細胞儀技術(shù)檢測PC12細胞凋亡。3、用不同濃度(OmM、0.5mM、1mM、2mM、4mM)的MPP+處理PC12細胞24h, Western-Blot免疫印跡法檢測PC12細胞內(nèi)PGC-1α、MCU 蛋白表達變化。4、用MCU激動劑精胺和MCU抑制劑Fu360、MCU過表達質(zhì)粒和干擾片段轉(zhuǎn)染處理后,再加1mMMPP+處理PC12細胞后檢測細胞凋亡率的變化。5、MCU過表達質(zhì)粒和干擾片段轉(zhuǎn)染、PGC-1 α干擾轉(zhuǎn)染處理后,再加1mMMPP+處理PC12細胞后檢測細胞氧化應(yīng)激變化。6、PGC-la干擾轉(zhuǎn)染處理后,Western-Blot免疫印跡法檢測PGC-1α干擾后MCU蛋白表達變化。結(jié)果1 MPP+導(dǎo)致PC12細胞增殖活力下降,并具有劑量和時間反應(yīng)關(guān)系MPP+濃度在0～4mM內(nèi),作用24h和48h時,PC12細胞存活率均隨著濃度的增加逐漸降低,各個加藥組細胞存活率與對照組相比,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。2 MPP+可誘導(dǎo)PC12細胞凋亡在光學(xué)顯微鏡下我們可看到正常PC12細胞體積較大,多呈梭型,表面有少量較細長的突起,核大呈梭型；用1mM的MPP+作用于PC12細胞24h后,PC12細胞核體積變小,細胞變圓。用終濃度5μg/ml Hoechst 33342染細胞核,熒光顯微鏡下可看到PC12細胞的細胞核出現(xiàn)細胞固縮、破碎等凋亡的特征性表現(xiàn)。1mM MPP-處理PC12細胞24h后,PARP出現(xiàn)切割；流式細胞儀測細胞凋亡率,結(jié)果顯示,PC12細胞凋亡率上升,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。3不同濃度MPP+對PC12細胞PGC-lα、MCU表達量的影響用不同濃度的MPP+處理PC12細胞24h,觀察MCU表達量的變化。結(jié)果顯示,隨著MPP+作用濃度升高,PGC-1α蛋白的表達量逐漸上升,MCU蛋白的表達量逐漸下降,表明MPP+作用于PC12細胞影響PGC-1α、MCU蛋白的表達量。4阻斷及激活MCU對MPP+誘導(dǎo)PC12細胞凋亡率的影響通過前面實驗,我們知道MPP+影響PC12細胞MCU的表達量,那么MCU是否參與了MPP+誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡呢?我們采用MCU的阻斷劑Ru360(10μM)和激活劑Sper(20μM)分別預(yù)處理PC12細胞1h后再加入MPP+作用24h,檢測Ru360和Sper預(yù)處理對MPP+誘導(dǎo)PC12細胞凋亡率的影響。我們發(fā)現(xiàn),Ru360+　MPP+組與僅MPP+處理組相比,細胞胞凋亡率上升,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05); Sper+MPP+組與僅MPP+處理組相比,細胞凋亡率下降,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。結(jié)果表明,MCU的阻斷劑Ru360預(yù)處理導(dǎo)致MPP+誘導(dǎo)PC12細胞凋亡率上升,而MCU的激活劑Sper預(yù)處理導(dǎo)致MPP+誘導(dǎo)PC12細胞凋亡率下降。5干擾及過表達MCU對MPP+誘導(dǎo)PC12細胞凋亡率的影響為進一步驗證MCU在MPP+誘導(dǎo)PC12細胞凋亡中的作用,我們分別采用RNA干擾和過表達技術(shù),下調(diào)和上調(diào)MCU的表達,免疫印跡法驗證干擾效率。MCU下調(diào)或上調(diào)后,加入1mM MPP+處理24h,觀察MCU下調(diào)或上調(diào)對MPP+誘導(dǎo)PC12細胞凋亡的影響。結(jié)果顯示,下調(diào)MCU導(dǎo)致MPP+誘導(dǎo)PC12細胞凋亡率上升,而上調(diào)MCU導(dǎo)致MPP+誘導(dǎo)PC12細胞凋亡率下降,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。上述結(jié)果表明,MCU參與了MPP+誘導(dǎo)PC12細胞的凋亡過程。6 MCU干擾及過表達在MPP+處理PC12細胞后的ROS含量變化MCU干擾及過表達后用1mMMPP+處理PC12細胞24h用ROS檢測試劑盒檢測這一過程ROS含量變化。結(jié)果顯示,MCU干擾組ROS顯著升高,MCU干擾可加重MPP+誘導(dǎo)的PC12細胞氧化應(yīng)激狀態(tài)。MCU過表達組ROS顯著性下降,MCU過表達后可減輕MPP+誘導(dǎo)的PC12細胞氧化應(yīng)激狀態(tài)。7改變PGCla表達對MPP+誘導(dǎo)細胞凋亡率的影響PGC-1a干擾片段1,干擾片段2和干擾片段3處理PC12細胞后可使MCU蛋白表達顯著性上升,PGC-1α可能是調(diào)控MCU的一個重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。與scrambled組相比,PGC-1α干擾片段處理組ROS水平顯著上升,說明PGC-1 α干擾可加重MPP+誘導(dǎo)的PC12細胞氧化應(yīng)激狀態(tài),進一步說明PGC-1α參與MPP+誘導(dǎo)的神經(jīng)元細胞氧化應(yīng)激這一過程。8 ROS在MPTP致凋亡中的作用用1mM MPP+處理PC12細胞24h,利用熒光探針DCFH-DA檢測PC12細胞活性氧的含量,結(jié)果與control組相比,1mM　MPP+處理PC12細胞使ROS顯著增多。用20mM　NAC預(yù)處理PC12細胞1h,然后用1mM　MPP+處理PC12細胞24h,結(jié)果說明NAC預(yù)處理ROS下降。用20mM　NAC預(yù)處理PC12細胞1h,然后用1mM　MPP+處理PC12細胞24h。結(jié)果說明,隨著MPP+濃度的升高,PGC-1α蛋白顯著性減少,MCU蛋白顯著性升高。這表明NAC預(yù)處理可能對PGC-1α蛋白和MCU蛋白有一定的調(diào)控作用,氧化應(yīng)激在MPP+處理PC12細胞中起作用。結(jié)論本研究的結(jié)果顯示,MPP+可誘導(dǎo)PC12細胞的凋亡。MPP+處理可使PC12細胞的PGC-1α蛋白表達上調(diào),MCU蛋白表達下降。阻斷、干擾或激活、過表達MCU對MPP+誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡分別起到協(xié)同和拮抗作用,PGC-1α干擾后可使MCU蛋白表達量上調(diào)。這些結(jié)果說明PGC-1α作為線粒體上重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,可調(diào)控氧化和抗氧化過程和作為線粒體內(nèi)膜上重要的鈣內(nèi)流通道蛋白MCU,參與且能抑制MPP+誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡。
[Abstract]:Parkinson ' s disease ( PD ) is a common neurodegenerative disease in the middle - aged and old people . It is characterized by the selective loss of dopaminergic neurons in the nigra dense part ( SNpc ) . The clinical symptoms include muscular rigidity , static tremor , slow motion and unstable posture . To date , the mechanism of Parkinson ' s disease has been studied by electron microscopy . The apoptosis of PC12 cells induced by MPP + was investigated by Western - Blot and Western - Blot . The apoptosis rate of PC12 cells induced by MPP + was significantly higher than that in MPP + treated group . 榪涗竴姝ヨ�存槑PGC-1偽鍙備笌MPP+璇卞�肩殑绁灳l忓厓緇嗚優(yōu)姘у寲搴旀縺榪欎竴榪囩▼.8 ROS鍦∕PTP鑷村噵浜′腑鐨勪綔鐢ㄧ敤1mM MPP+澶勭悊PC12緇嗚優(yōu)24h,鍒╃敤鑽у厜鎺㈤拡DCFH-DA媯，

本文編號：1479964