發(fā)布時(shí)間：2020-11-21 12:02

　　 研究背景:骨肉瘤是最常見的骨惡性腫瘤,其發(fā)病人數(shù)大約占到所有骨惡性腫瘤的30%左右,尤其是小兒中發(fā)病率較高。骨肉瘤的十年生存率大約是60Y%到75%。目前對(duì)于骨肉瘤的治療,一般是術(shù)前化療,然后行局部廣泛切除的保肢術(shù)或行截肢術(shù),術(shù)后化療。目前用于化療的藥物對(duì)于骨肉瘤細(xì)胞和人體正常細(xì)胞都有明顯的殺傷作用,副作用較大,而這些較大的副作用也有可能進(jìn)一步降低了骨肉瘤病人的生存率。因此,需要探索新的化療藥物,增加對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的殺傷作用,同時(shí)降低對(duì)正常組織的損傷,從而進(jìn)一步改善病人的預(yù)后。姜黃素是從植物中提取的一種天然的化學(xué)成分,在中國(guó)被作為一種中藥來治療多種疾病。目前的研究表明,姜黃素可抑制肝癌、胃癌、胰腺癌等惡性腫瘤;姜黃素可以通過作用于轉(zhuǎn)錄因子、凋亡基因、細(xì)胞信號(hào)分子等多種機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤作用。姜黃素的藥理作用廣泛,毒性較低,在人體中的耐受性良好。p53基因是迄今發(fā)現(xiàn)與人類腫瘤相關(guān)性最高的基因,也是腫瘤細(xì)胞中最容易發(fā)生突變失活的基因。p53的正常功能是在G1期檢查DNA損傷點(diǎn),監(jiān)視細(xì)胞基因的完整性。對(duì)于p53在姜黃素誘導(dǎo)的凋亡中所發(fā)揮的作用是有爭(zhēng)議的,一些研究認(rèn)為這些凋亡作用是p53依賴性的,而另一些研究認(rèn)為在這些凋亡作用中正常功能的p53不是必須的,這些研究差異的產(chǎn)生可能是由于所研究的腫瘤類型及細(xì)胞系的不同。由于p53基因突變?cè)诠侨饬黾?xì)胞中的發(fā)生率非常高,如果姜黃素的抗骨肉瘤作用是p53途徑依賴性的,將會(huì)大大限制它作為一種抗骨肉瘤藥物的使用。研究目的:研究姜黃素對(duì)骨肉瘤的作用規(guī)律,研究其作用的分子機(jī)制,并分析其作用是否為p53途徑依賴性,對(duì)將來姜黃素的臨床應(yīng)用前景是非常重要的。本研究選擇p53基因型不同的兩種人骨肉瘤細(xì)胞系,即p53缺失型MG-63細(xì)胞系和p53野生型U2OS細(xì)胞系,通過研究不同濃度姜黃素對(duì)這兩種細(xì)胞系的抑制作用,分析姜黃素對(duì)U2OS及MG-63的細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡及侵襲作用的影響,研究姜黃素的抗骨肉瘤作用隨其濃度及作用時(shí)間變化的規(guī)律,并研究其抗骨肉瘤作用的分子機(jī)制;研究這兩種細(xì)胞系對(duì)姜黃素敏感性的差異,探討姜黃素的抗骨肉瘤作用是否為p53依賴性。研究方法:第一部分:姜黃素對(duì)人骨肉瘤p53缺失型MG-63細(xì)胞系增殖、凋亡和侵襲的作用規(guī)律研究1.骨肉瘤p53缺失型MG-63細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。2.MG-63細(xì)胞系分為4組,A組為空白對(duì)照組,加入PBS緩沖液;B組培養(yǎng)液中加入姜黃素,濃度調(diào)整為5μmol/L;C組培養(yǎng)液中加入姜黃素,濃度調(diào)整為10μmol/L;D組培養(yǎng)液中加入姜黃素,濃度調(diào)整為20μmol/L。3.細(xì)胞增殖能力檢測(cè)。采用MTT法檢測(cè)MG-63細(xì)胞的增殖能力。細(xì)胞增殖試驗(yàn)在96孔板中進(jìn)行檢測(cè)(1X104細(xì)胞/孔)。在加入不同濃度的姜黃素之后,MG-63細(xì)胞在5%二氧化碳,溫度為37℃的環(huán)境中培養(yǎng)48小時(shí)或72小時(shí)。將10μl的5mg/ml的MTT溶液分別加入各孔中,繼續(xù)在37℃的環(huán)境中將細(xì)胞培養(yǎng)4小時(shí)。向各孔中分別加入二甲基亞砜(DMSO),采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀,在490nm波長(zhǎng)處分別測(cè)量各孔的吸光值。4.細(xì)胞凋亡水平檢測(cè)。將MG-63細(xì)胞系接種于12孔板(1.5×105/孔),分別加入濃度為0-20 μmol/L的姜黃素,培養(yǎng)24小時(shí)后收集各組細(xì)胞。采用凋亡檢測(cè)試劑盒(eBioscience,San Diego,CA,USA)進(jìn)行檢測(cè)。懸浮于緩沖液中的細(xì)胞,加入Annexin V-FITC和PI后置于室溫避光處反應(yīng)15分鐘。通過FACSCalibur細(xì)胞分析儀進(jìn)行分析。Annexin V陽(yáng)性的細(xì)胞為凋亡細(xì)胞。5.腫瘤細(xì)胞侵襲能力檢測(cè)。無血清DMEM培養(yǎng)基按1:19稀釋Matrigel,50μl鋪于transwell小室。1X 105的MG-63細(xì)胞,分別加入不同濃度的姜黃素培養(yǎng)48小時(shí),下室加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)48小時(shí)后,去除上室的Matrigel;細(xì)胞采用甲醇固定,結(jié)晶紫染色;顯微鏡下觀察,拍照,計(jì)數(shù)。6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)均以至少三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(Mean土SD)表示。對(duì)于兩組數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用配對(duì)t檢驗(yàn)(paired Student' s t-test),多于兩組數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用單因素方差分析(one-way analysis of variance)。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義定義為*0.05,**P0.01。第二部分:姜黃素誘導(dǎo)人骨肉瘤p53缺失型MG-63細(xì)胞系凋亡的分子機(jī)制研究Western Blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。MG-63細(xì)胞系各組分別加入濃度為0-20 μmol/L的姜黃素,Western Blot法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。一抗分別針對(duì) Bcl-2,Bax,cleaved PARP,Caspase-3,和β-actin。12 小時(shí)后收集處理后的細(xì)胞,用預(yù)冷的4℃的PBS緩沖液(pH 7.4)洗兩次,然后加入蛋白裂解液,置于冰上半小時(shí)。裂解產(chǎn)物于4℃下12000rpmm離心,進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測(cè)定。SDS-PAGE電泳分離樣品。分離后的蛋白被轉(zhuǎn)移到PVDF膜。分別采用一抗和二抗處理。采用odyssey紅外成像系統(tǒng)進(jìn)行探測(cè)。β-actin作為內(nèi)參。第三部分:姜黃素對(duì)人骨肉瘤p53缺失型MG-63細(xì)胞系及p53野生型U20S細(xì)胞系增殖、凋亡及侵襲影響的比較分析1.骨肉瘤p53缺失型MG-63細(xì)胞系和p53野生型U20S細(xì)胞系均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。2.U20S細(xì)胞系分為4組,A組為空白對(duì)照組,加入PBS緩沖液;B組培養(yǎng)液中加入姜黃素,濃度為5分mol/L;C組培養(yǎng)液中加入姜黃素,濃度調(diào)整為10μmol/L;D組培養(yǎng)液中加入姜黃素,濃度調(diào)整為20μmol/L。MG-63細(xì)胞系分組同前。3.細(xì)胞增殖能力檢測(cè)。采用MTT法檢測(cè)MG-63細(xì)胞及U20S細(xì)胞的增殖能力。細(xì)胞增殖試驗(yàn)在96孔板中進(jìn)行檢測(cè)(1X104細(xì)胞/孔)。在加入不同濃度的姜黃素之后,MG-63細(xì)胞及U2OS細(xì)胞在5%二氧化碳,溫度為37℃的環(huán)境中培養(yǎng)48小時(shí)或72小時(shí)。將10μl的5mg/ml的MTT溶液分別加入各孔中,繼續(xù)在37℃的環(huán)境中將細(xì)胞培養(yǎng)4小時(shí)。向各孔中分別加入二甲基亞砜(DMSO),采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀,在490nm波長(zhǎng)處分別測(cè)量各孔的吸光值。4.細(xì)胞凋亡水平檢測(cè)。將MG-63、U2OS這兩種p53基因型不同的細(xì)胞分別接種于12孔板(1.5×105/孔),分別加入濃度為0-20 μmol/L的姜黃素,培養(yǎng)24小時(shí)后收集各組細(xì)胞。采用凋亡檢測(cè)試劑盒(eBioscience,SanDiego,CA,USA)進(jìn)行檢測(cè)。懸浮于緩沖液中的細(xì)胞,加入AnnexinV-FITC和PI后置于室溫避光處反應(yīng)15分鐘。通過FACSCalibur細(xì)胞分析儀進(jìn)行分析。Annexin V陽(yáng)性的細(xì)胞為凋亡細(xì)胞。5.腫瘤細(xì)胞侵襲能力檢測(cè)。無血清DMEM培養(yǎng)基按1:19稀釋Matrigel,50μl鋪于transwell小室。1×103的MG-63細(xì)胞及U20S細(xì)胞,分別加入不同濃度的姜黃素培養(yǎng)48小時(shí),下室加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)48小時(shí)后,去除上室的Matrigel;細(xì)胞采用甲醇固定,結(jié)晶紫染色;顯微鏡下觀察,拍照,計(jì)數(shù)。6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)均以至少三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。對(duì)于兩組數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用配對(duì)t檢驗(yàn)(paired Student' s t-test),多于兩組數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用單因素方差分析(one-way analysis of variance)。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義定義為*P0.05,**P0.01。研究結(jié)果:第一部分:姜黃素對(duì)人骨肉瘤p53缺失型MG-63細(xì)胞系增殖、凋亡和侵襲的作用規(guī)律研究1.MTT法檢測(cè)不同濃度姜黃素及不同作用時(shí)間對(duì)人骨肉瘤MG-63細(xì)胞系增殖的影響。為了探討姜黃素對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞系MG-63(p53缺失型)增殖的影響,MG-63細(xì)胞在不同姜黃素濃度下培養(yǎng)48h和72h。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,隨著姜黃素濃度的增高,MG-63細(xì)胞的增殖受到明顯抑制,其受到抑制的程度與姜黃素濃度呈現(xiàn)依賴關(guān)系。另外,本實(shí)驗(yàn)也研究了骨肉瘤細(xì)胞增殖與姜黃素作用時(shí)間的關(guān)系,結(jié)果顯示姜黃素作用時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)骨肉瘤細(xì)胞受抑制的程度也有明顯的相關(guān)性。姜黃素作用72小時(shí)組,骨肉瘤細(xì)胞受抑制的程度顯著高于48小時(shí)組,其差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由上可見,在0-20μmol/L的范圍內(nèi),姜黃素的濃度越高,作用的時(shí)間越長(zhǎng),骨肉瘤增殖受抑制的程度也越高。2.姜黃素能夠增強(qiáng)人骨肉瘤細(xì)胞MG-63的凋亡水平研究表明,姜黃素不僅能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖,而且能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。為了驗(yàn)證姜黃素對(duì)骨肉瘤細(xì)胞系的促凋亡作用,將濃度為5,10,20μmol/L的姜黃素作用24h后,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)p53缺失型MG-63細(xì)胞系的凋亡水平。結(jié)果顯示,隨著姜黃素濃度的增高,MG-63細(xì)胞的凋亡率明顯增高,增高的程度與姜黃素的濃度呈正比。由上可見,在0-20μmol/L的范圍內(nèi),姜黃素的濃度越高,MG-63細(xì)胞系的凋亡率越高。3.不同濃度姜黃素對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞系MG-63侵襲能力的影響有研究報(bào)道,姜黃素不僅能夠通過誘導(dǎo)凋亡,抑制腫瘤細(xì)胞的增殖,還能夠降低腫瘤的侵襲能力。為了進(jìn)一步驗(yàn)證姜黃素對(duì)骨肉瘤侵襲的抑制作用,我們采用Transwell細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)分別對(duì)姜黃素抑制MG-63侵襲能力進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示,隨著姜黃素濃度的提高,MG-63細(xì)胞系的侵襲能力都有了顯著的下降。第二部分:姜黃素誘導(dǎo)人骨肉瘤p53缺失型MG-63細(xì)胞系凋亡的分子機(jī)制研究為了進(jìn)一步探討在p53缺失型MG-63細(xì)胞系中,姜黃素促進(jìn)凋亡的具體分子機(jī)制,我們以Western Blot法檢測(cè)MG-63細(xì)胞中抗凋亡基因Bcl-2和凋亡基因Bax,以及caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)蛋白Caspase-3、cleaved PARP,在不同濃度的姜黃素作用之后的表達(dá)水平。檢測(cè)發(fā)現(xiàn),Bcl-2蛋白的表達(dá)量隨著姜黃素濃度的增高而明顯降低,呈劑量依賴性,Bax、Caspase-3、cleaved PARP等蛋白的表達(dá)量都隨著姜黃素濃度的增高而逐漸增高,并呈劑量依賴性。同時(shí),Bax/Bcl-2的比例隨著姜黃素濃度的增高而顯著增高。由上可見,姜黃素對(duì)骨肉瘤細(xì)胞多種促凋亡蛋白的表達(dá)具有上調(diào)作用,并對(duì)抗凋亡蛋白的表達(dá)具有抑制作用。姜黃素通過上調(diào)Bax/Bcl-2的比例并激活Caspase-3來促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的凋亡。這表明,姜黃素促進(jìn)人骨肉瘤MG-63細(xì)胞系的凋亡作用的分子機(jī)制與線粒體通路有關(guān)。第三部分:姜黃素對(duì)人骨肉瘤p53缺失型MG-63細(xì)胞系及p53野生型U20S細(xì)胞系增殖、凋亡及侵襲影響的比較分析1.MTT法檢測(cè)不同濃度姜黃素對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞MG-63和U20S增殖的影響。為了探討姜黃素對(duì)不同p53基因型骨肉瘤細(xì)胞系MG-63(P53缺失型)和U20S(P53野生型)增殖的影響,MG-63、U20S細(xì)胞在不同姜黃素濃度下培養(yǎng)48h和72h。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,隨著姜黃素濃度的增高,MG-63和U20S細(xì)胞的增殖都受到明顯抑制,其受到抑制的程度與姜黃素濃度都呈現(xiàn)依賴關(guān)系。另外,在這兩種細(xì)胞系中,姜黃素作用72小時(shí)組,骨肉瘤細(xì)胞受抑制的程度都顯著高于48小時(shí)組。p53缺失型MG-63細(xì)胞系比p53野生型U20S細(xì)胞系對(duì)姜黃素更敏感,在作用時(shí)間相同,姜黃素濃度相同的情況下,MG-63細(xì)胞系和U20S細(xì)胞系都受到明顯的抑制,但是MG-63細(xì)胞系受抑制的程度更高。在20μmol/L的姜黃素作用72小時(shí)的情況下,MG-63受抑制的程度可達(dá)到80%左右。根據(jù)本實(shí)驗(yàn),p53缺失型MG-63細(xì)胞系比p53野生型U20S細(xì)胞系對(duì)姜黃素更敏感,在相同情況下,其增殖受抑制的程度更高。這個(gè)結(jié)果表明,姜黃素抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖的作用是p53非依賴性的。2.姜黃素能夠增強(qiáng)骨肉瘤細(xì)胞MG-63和U20S的凋亡水平為了驗(yàn)證姜黃素對(duì)骨肉瘤細(xì)胞系的促凋亡作用,將濃度為5,10,20μnol/L的姜黃素作用24h后,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)p53缺失型MG-63細(xì)胞系和p53野生型U2OS細(xì)胞系的凋亡水平。結(jié)果顯示,隨著姜黃素濃度的增高,MG-63細(xì)胞和U20S細(xì)胞的凋亡率都明顯增高,增高的程度與姜黃素的濃度都呈正比。在姜黃素濃度相同的情況下,P53缺失型MG-63細(xì)胞系比p53野生型U20S細(xì)胞系凋亡率更高,尤其是在姜黃素20lμol/L的情況下,MG-63細(xì)胞系的凋亡率大約為84.21%,高于U20S細(xì)胞系的42.81%。由上可見,p53缺失型MG-63細(xì)胞系比p53野生型U20S細(xì)胞系對(duì)姜黃素更敏感,相同姜黃素濃度情況下,MG-63細(xì)胞系的凋亡率更高。這個(gè)結(jié)果表明,姜黃素誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡的作用是p53非依賴性的。3.不同濃度姜黃素對(duì)骨肉瘤細(xì)胞MG-63和U20S侵襲能力的影響為了進(jìn)一步驗(yàn)證姜黃素對(duì)骨肉瘤侵襲的抑制作用,我們采用Transwell細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)分別對(duì)姜黃素抑制MG-63和U20S侵襲能力進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示,隨著姜黃素濃度的提高,MG-63細(xì)胞系與U20S細(xì)胞系的侵襲能力都有了顯著的下降。與細(xì)胞增殖和凋亡的情況類似,在腫瘤侵襲實(shí)驗(yàn)中,p53缺失型MG-63細(xì)胞系比p53野生型U20S細(xì)胞系對(duì)姜黃素更敏感。相同姜黃素濃度情況下,MG-63細(xì)胞侵襲能力下降的程度更多。這個(gè)結(jié)果表明,姜黃素對(duì)骨肉瘤細(xì)胞侵襲能力的抑制也是p53非依賴性的。結(jié)論:隨著姜黃素濃度的升高,人骨肉瘤MG-63和U20S細(xì)胞系的增殖受到明顯的抑制,凋亡水平明顯增高,侵襲能力逐漸降低;且在一定范圍內(nèi),骨肉瘤細(xì)胞系受到抑制的程度與姜黃素的濃度及作用時(shí)間呈現(xiàn)依賴關(guān)系。無論是細(xì)胞增殖能力、凋亡水平還是細(xì)胞侵襲能力,在相同條件下,P53缺失型MG-63細(xì)胞系均比P53野生型U20S細(xì)胞系對(duì)姜黃素更為敏感。這表明,姜黃素的抗骨肉瘤作用是通過p53非依賴性途徑實(shí)現(xiàn)的。為了進(jìn)一步探討姜黃素通過p53非依賴性途徑促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡的具體分子機(jī)制,進(jìn)行了 WesternBlot檢測(cè),結(jié)果表明,隨著姜黃素濃度的增高,Bax的表達(dá)量明顯增高,而Bcl-2的表達(dá)量逐漸降低,Bax/Bcl-2的比例隨著姜黃素的濃度的增高而成比例的增高;隨著姜黃素濃度的升高,cleaved PARP和Caspase-3的表達(dá)量也都顯著增高。綜上,姜黃素可以通過線粒體通路發(fā)揮抗骨肉瘤作用,通過升高Bax/Bcl-2的比例并激活Caspase-3來誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡,這種作用為p53非依賴性。姜黃素作為傳統(tǒng)化療方案的重要輔助和補(bǔ)充,在國(guó)內(nèi)外受到廣泛的關(guān)注和研究。p53突變?cè)趷盒阅[瘤中大量存在,而p53突變將會(huì)導(dǎo)致腫瘤對(duì)化療產(chǎn)生廣泛耐藥性;姜黃素對(duì)骨肉瘤的p53非依賴性的細(xì)胞毒性作用,提示姜黃素對(duì)那些因?yàn)镻53表達(dá)或功能異常而對(duì)傳統(tǒng)化療方案產(chǎn)生耐藥性的腫瘤,可能具有良好的治療效果。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R285
【部分圖文】：

圖２．不同濃度姜黃素對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞系ＭＧ－６３凋亡的影響??

圖３．不同濃度姜黃素對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞系ＭＧ－６３侵襲能力的影響??

圖４．姜黃素能夠影響骨肉瘤細(xì)胞ＭＧ－６３凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平??
【參考文獻(xiàn)】

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1 Pornprom Yoysungnoen;Ponthip Wirachwong;Chatchawan Changtam;Apichart Suksamrarn;Suthiluk Patumraj;;Anti-cancer and anti-angiogenic effects of curcumin and tetrahydrocurcumin on implanted hepatocellular carcinoma in nude mice[J];World Journal of Gastroenterology;2008年13期

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本文編號(hào)：2892967