發(fā)布時間：2020-11-19 12:26

　　 選題依據:抑郁癥是一種慢性復發(fā)性情緒障礙,是全球常見的疾病之一。目前,治療抑郁癥以西藥為主,但臨床用藥中常出現毒副作用大及耐受性差等問題,從作用溫和、毒副作用小的中藥中研發(fā)理想的抗抑郁藥物成為研究熱點。本課題組在前期研究中已明確源自逍遙散君藥柴胡中的多炔類成分具有抗抑郁活性,且大鼠體內藥動學實驗表明含量較高的柴胡多炔RB-2和RB-4在體內呈現出吸收較快消除較慢的特征,在體外單胺遞質再攝取抑制活性測試中均表現出較強的抑制活性,有望開發(fā)為抗抑郁新藥。因此,探尋柴胡多炔RB-2和RB-4的體內外代謝特征、參與代謝過程的代謝酶的類型及與CYP450代謝酶活性的關系等體內外代謝特征成為必不可少的研究內容。通過研究具有適宜藥代動力學參數的候選化合物體內外代謝特征,分析并鑒定其代謝物,闡明代謝途徑,盡可能明確藥物及代謝物的藥理及毒理作用,為研發(fā)降低成本,也為后期臨床安全用藥提供科學依據。目的:明確柴胡多炔RB-2和RB-4體內外代謝特征,闡明其代謝途徑,探尋介導柴胡多炔生物轉化的CYP450酶,并研究柴胡多炔對CYP450酶活性的影響,通過上述研究綜合評價柴胡多炔的代謝特征,為后期抗抑郁新藥的開發(fā)提供科學依據。方法:1.正常雄性ICR小鼠隨機分成空白對照組和2個給藥組,灌胃給予小鼠劑量均為100 mg·kg-1的柴胡多炔RB-2和RB-4,收集小鼠空白生物樣品及血清、尿液、糞便和膽汁,生物樣品的數據采集采用RSLC-Q Extractive Orbitrap-MS分析技術,并結合Compound Discoverier代謝分析軟件對樣品進行分析。通過分析柴胡多炔原型及代謝物的一級質譜和二級質譜裂解規(guī)律,推測柴胡多炔在正常小鼠體內的代謝途徑。2.將RB-2和RB-4分別加入鼠和混合人肝微粒體溫孵體系中共孵育,運用與研究體內代謝物相同的方法分析檢測其生物樣本,推測柴胡多炔在鼠和混合人肝微粒體共孵育體系中的Ⅰ相和Ⅱ相代謝途徑,并考察柴胡多炔在體內外及種屬間代謝特征的差異。3.針對柴胡多炔在混合人肝微粒體中主要代謝途徑,采用專屬性化學抑制劑法,在正常的混合人肝微粒體孵育體系中加入FDA推薦的CYP450酶各亞型專屬性化學抑制劑α-萘黃酮(CYP1A2)、舍曲林(CYP2B6)、孟魯司特(CYP2C8)、磺胺苯吡唑(CYP2C9)、噻氯匹定(CYP2C19)、奎尼丁(CYP2D6)、氯美噻唑(CYP2E1)和酮康唑(CYP3A4),探尋各代謝物的生成抑制率,初步推測介導柴胡多炔生物轉化的CYP450酶;同時采用人源重組CYP450單純酶法,分析其在人源重組CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2E1和CYP3A4單純酶中在各代謝物生成的貢獻率,進一步推測介導柴胡多炔生物轉化過程的CYP450酶。結合兩種方法確定介導柴胡多炔生物轉化的CYP450酶的亞型。4.建立基于UHPLC-MS/MS技術的各亞型CYP450酶探針底物定量分析方法,采用MRM掃描模式,對采集數據進行分析,評價柴胡多炔對CYP450酶活性的影響。通過分析在鼠肝微粒體共孵育體系中探針底物非那西丁(CYP1A2)、依法韋侖(CYP2B6)、紫杉醇(CYP2C8)、甲苯磺丁脲(CYP2C9)、右美沙芬(CYP2D6)、氯唑沙宗(CYP2E1)和睪酮(CYP3A4)反應抑制率,初步研究柴胡多炔對7種CYP450酶活性的影響。結果:1.通過與空白對照組樣品比較,鑒定出在小鼠體內,柴胡多炔RB-2共產生13種代謝物,主要存在于血清2h和糞便樣品中。根據推測出的代謝物結構,按其被代謝的程度,可將Ⅰ相代謝中發(fā)生的氧化反應的類型分為如下3種;氧化(M1)、脫飽和+氧化(M2)和雙重氧化(M3)、脫飽和+雙重氧化(M4),Ⅱ相代謝通常會在Ⅰ相代謝反應發(fā)生的基礎上發(fā)生結合反應,如葡萄糖醛酸結合(M8)、氧化+葡萄糖醛酸結合(M5),其他的結合反應類型為氧化+乙�；�(M6)和氧化+GSH結合(M7);柴胡多炔RB-4的體內代謝與RB-2類似,共鑒定出14種代謝物,主要存在于血清2h和糞便樣品中。在Ⅰ相代謝中主要發(fā)生氧化反應,出現M1、M3、M4這3種類型代謝物,Ⅱ相代謝物M5、M7和M8,另外,RB-4的II相代謝中氧化+硫酸化(M9)為其特有的代謝類型。兩種柴胡多炔及其代謝物均主要隨糞便排出體外。2.通過與空白孵育基質比較,在與鼠肝微粒體共孵育體系中鑒定出柴胡多炔RB-2和RB-4的代謝物分別為5種和3種,其中M1、M4和M5與體內代謝物相同。同時,M11(水合+氧化+葡萄糖醛酸結合)為鼠肝微粒體系中特有。在與混合人肝微粒體共孵育體系中,柴胡多炔RB-2和RB-4的代謝類型與鼠肝微粒體中的有相似之處(M1,M4和M5),但混合人肝微粒體中出現的水合+雙重氧化(M10)類型為其所特有,在鼠微粒體體系和體內生物樣品中均未鑒定出。3.采用化學抑制劑法考察在HLMs中CYP450酶的亞型,結果表明,參與柴胡多炔RB-2代謝物M4、M1和M10生物轉化的酶分別為CYP2C8、CYP2E1和CYP2C9;參與柴胡多炔RB-4代謝物M4、M10-1和M10-2生物轉化的酶分別為CYP3A4、CYP2C9和CYP2C9。人源重組CYP450單純酶法研究結果表明,在柴胡多炔RB-2的代謝轉化中,參與代謝物M4生成的CYP450酶貢獻程度大小為CYP2C9CYP2E1CYP2C8,代謝物M1的生成僅有CYP2E1參與,在M10的生成中,CYP450酶的貢獻程度為CYP2C9CYP2C8;在柴胡多炔RB-4的代謝轉化中,CYP450酶在代謝物M4的生成中貢獻程度大小為CYP2C8CYP3A4,代謝物M10-1中其貢獻程度為CYP2C9CYP2C8,代謝物M10-2為CYP2C9CYP2B6CYP2C8。結合兩種方法,介導柴胡多炔生物轉化的CYP450酶主要為CYP2C9和CYP2E1,CYP2B6和CYP3A4在其代謝過程中也發(fā)揮著作用。4.運用探針底物法,分析柴胡多炔對CYP450酶的影響,當探針底物反應抑制率大于50%時,初步判斷化合物對CYP450酶具有抑制作用。實驗結果表明,柴胡多炔RB-2和RB-4對CYP1A2的抑制程度分別為38%和24%,對CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4的抑制程度均小于10%。結論:1.通過研究柴胡多炔的在小鼠體內的代謝特征,明確具有相似結構的柴胡多炔的主要代謝途徑為氧化反應,葡萄糖醛酸結合反應等,主要隨糞便排出體外。2.根據研究探針底物抑制結果,初步推測柴胡多炔對CYP450酶沒有影響。3.通過上述研究,說明柴胡多炔的體內外代謝性質較佳,能夠作為抗抑郁藥物研發(fā)過程中的候選化合物進行深入研究。
【學位單位】：山西大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2017
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

柴胡多炔 RB-2 和 RB-4 的代謝研究1.2 研究思路、技術路線圖、研究內容及創(chuàng)新點1.2.1 研究思路、技術路線圖、研究內容本課題的研究思路：本課題主要根據前期已篩選出的柴胡石油醚部位中含量較高的多炔類成分 RB-2 和 RB-4 為研究對象，首先對其進行體內代謝研究，明確其代謝途徑。隨后，采用體外代謝的研究方法，分析鑒定主要代謝物。進一步研究介導生成相關代謝物的代謝酶。最后，考察柴胡多炔對代謝酶的活性有影響，根據上述研究，綜合評價柴胡多炔在體內外的代謝特征。本實驗的技術流程圖如下：

20圖 3.3 RB-2 的一級質譜（A）和二級質譜（B）Figure 3.3 The MS（A） and MS2（B） positive mass spectra of RB-2柴胡多炔 RB-4 的化學結構與 RB-2 具有相似性，RB-4 準分子離子峰為[M+H]+m/z 243.1749（如圖 3.4 (A)所示），一級掃描時顯示出的分子離子峰，除準

22圖 3.4 RB-4 的一級質譜（A）和二級質譜（B）Figure 3.4 The MS（A） and MS2（B） positive mass spectra of RB-43.4.2 柴胡多炔 RB-2 的代謝物結構鑒定將“3.3.5 生物樣品數據采集”中所述 Full Scan 掃描模式采集的數據導入Compound Discoverier 2.0 軟件中進行代謝物擬合，通過與空白樣品比較，尋找可能
【引證文獻】

相關博士學位論文 前1條

1 邢婕;柴胡質量評價方法及其對肝臟功能影響研究[D];山西大學;2018年

本文編號：2890005