發(fā)布時(shí)間：2020-07-07 21:09

【摘要】：隨著人口的老齡化和環(huán)境的破壞,癌癥已經(jīng)成為了危害人類健康影響人類壽命的一種主要疾病之一。隨著環(huán)境惡化及工作壓力增加,癌癥的發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)逐年遞增的趨勢(shì)。據(jù)國家中央癌癥登記中心的數(shù)據(jù)結(jié)果表明,2015年預(yù)計(jì)有429.2萬新發(fā)癌癥病例,其中281.4萬癌癥患者死亡,肺癌的死亡率高居榜首。目前,化學(xué)藥物治療仍是治療肺癌的主要手段之一,但其毒副作用大、腫瘤耐藥性的缺點(diǎn),使得患者3年生存率大大降低,生活和生存質(zhì)量下降。針對(duì)這一個(gè)現(xiàn)狀,尋找一種抗腫瘤效果好、毒副作用低的天然化合物,設(shè)計(jì)合成具有腫瘤靶向性的化合物更成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。中醫(yī)藥為我國的寶庫,在與疾病做斗爭(zhēng)的過程中,基于人體治療和預(yù)防疾病的臨床有效驗(yàn)方成為新藥篩選研發(fā)的寶貴線索。本課題在前期文獻(xiàn)檢索、專利查詢等發(fā)現(xiàn)肉桂的揮發(fā)油具有抗腫瘤作用,而肉桂醛是其中含量較高的單體化合物之一,通過分析其官能團(tuán)-“醛”結(jié)構(gòu),根據(jù)醛的理化性質(zhì)分析其具有抗氧化和氧化的“雙重”作用,基于其構(gòu)-效關(guān)系,本課題擬對(duì)其抗肺癌作用及其機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)的研究。同時(shí),ZT系列化合物是本課題組設(shè)計(jì)合成的一類以氨基酸為靶向載體的新型靶向性抗腫瘤藥物,其中分別以谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸為癌組織靶向性分布載體,設(shè)計(jì)合成了ZT-3、ZT-18、ZT-21化合物,經(jīng)過接種人肺癌荷瘤動(dòng)物驗(yàn)證其均有不同腫瘤選擇性的抗腫瘤作用。本課題也將利用腫瘤組織對(duì)不同氨基酸的選擇性吸收和分布,對(duì)同樣具有在肺癌組織中具有靶向性分布的天冬氨酸、瓜氨酸、天冬酰胺進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾,設(shè)計(jì)合成ZT-6、ZT-8、ZT-9化合物。本論文主要分為三章:第一章對(duì)肉桂醛中藥單體體外抗肺癌藥效學(xué)進(jìn)行研究,第二章系統(tǒng)地闡述肉桂醛對(duì)肺癌的分子靶標(biāo)及其潛在的作用機(jī)制;第三章擬用天冬氨酸、天冬酰胺、瓜氨酸為靶向載體,與草酰氯單乙酯進(jìn)行縮合藕連成三羧酸循環(huán)中關(guān)鍵代謝物質(zhì)草酰乙酸的類似物ZT-6、8、9,通過改進(jìn)合成工藝,摸索最佳反應(yīng)條件,提高純度至95%以上,獲得不易吸潮的固體粉末,為成藥性評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)。第一章肉桂醛體外抗肺癌藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)研究采用MTT法檢測(cè)肉桂醛對(duì)非小細(xì)胞肺癌SPC-A1細(xì)胞的增殖影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,不同濃度的肉桂醛(0、25、50、100、200μM·L-1)對(duì)肺癌SPC-A1處理后,其增殖情況都受到不同程度的抑制作用,其影響呈現(xiàn)濃度和時(shí)間依賴性。通過SPSS VII數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),體外給予肉桂醛24、48、72hrs后,其抗SPC-A1增殖的半數(shù)抑制濃度IC50分別為135.7、41.70和31.71μM·L-1。說明肉桂醛在體外抑制非小細(xì)胞肺癌SPC-A1細(xì)胞的增殖呈現(xiàn)出較好的時(shí)間依賴性。第二章肉桂醛體外抗肺癌機(jī)制研究第一節(jié)肉桂醛誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)(1)采用Hoechst 33258熒光染色觀察肉桂醛對(duì)非小細(xì)胞肺癌SPC-A1細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,不同濃度的肉桂醛(0、25、50、100、200μM·L-1)對(duì)肺癌SPC-A1細(xì)胞處理后,置熒光顯微鏡下觀察可見肺癌細(xì)胞數(shù)量減少,細(xì)胞核固縮,濃染而呈亮藍(lán)色,出現(xiàn)凋亡小體,其數(shù)量與肉桂醛作用濃度正相關(guān)。說明肉桂醛能引起肺癌SPC-A1細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)的變化,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。(2)采用流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合FITC-AnnexinV/PI雙標(biāo)記染色法檢測(cè)肉桂醛對(duì)非小細(xì)胞肺癌SPC-A1細(xì)胞的凋亡情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,不同濃度的肉桂醛(0、25、50、100、200μM·L-1)作用SPC-A1細(xì)胞24 h后的總凋亡率分別0.93%,11.5%,26.9%,46.3%,64.4%,呈濃度依賴性。并且,數(shù)值與MTT法檢測(cè)所得的抑制率基本一致,說明肉桂醛影響SPC-A1細(xì)胞的增殖與誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡有關(guān)。第二節(jié)肉桂醛對(duì)肺癌細(xì)胞周期的影響采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肉桂醛對(duì)非小細(xì)胞肺癌SPC-A1細(xì)胞的周期影響。通過PI染色,觀察到對(duì)照組是典型的腫瘤細(xì)胞增殖周期的峰形,而在肉桂醛作用SPC-A1細(xì)胞12 h后,細(xì)胞周期的各個(gè)時(shí)期均發(fā)生了顯著的變化,隨著肉桂醛濃度的升高,細(xì)胞S期比例隨著肉桂醛濃度升高,表現(xiàn)出一定的濃度依賴性,但G0/G1期與G2/M期沒有表現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,肉桂醛有可能通過阻滯SPC-A1細(xì)胞周期的S期,影響有絲分裂的進(jìn)行從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。第三節(jié)肉桂醛對(duì)肺癌細(xì)胞線粒體膜電位的影響采用流式細(xì)胞術(shù)通過JC-1熒光探針檢測(cè)肉桂醛對(duì)非小細(xì)胞肺癌SPC-A1的線粒體膜電位(MMP)的影響。在肉桂醛處理SPC-A1 12 h后,不同濃度的實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組均表現(xiàn)出了線粒體膜電位的下降現(xiàn)象,且隨著肉桂醛濃度的不斷增加,膜電位下降的細(xì)胞比例變大,呈現(xiàn)濃度依賴性。MMP下降說明肉桂醛誘導(dǎo)的凋亡屬于線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑。第四節(jié)肉桂醛對(duì)細(xì)胞活性氧的影響采用流式細(xì)胞術(shù)通過DCFH-DA熒光探針檢測(cè)肉桂醛對(duì)非小細(xì)胞肺癌SPC-A1胞內(nèi)活性氧水平的影響。結(jié)果顯示,與對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比不同濃度的肉桂醛處理SPC-A1細(xì)胞12 h后,低濃度的肉桂醛即能提高活性氧ROS的水平,但高濃度的肉桂醛升高活性氧的水平更加顯著,呈現(xiàn)出很明顯的濃度依賴性。說明肉桂醛有可能通過擾亂細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡,尤其是提高ROS水平來誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。第五節(jié)肉桂醛對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞Bax和Bcl-2凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。利用Western Blot檢測(cè)分析Bax和Bcl-2凋亡相關(guān)蛋白表達(dá),實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,不同濃度的肉桂醛孵育SPC-A1細(xì)胞24 h后,促凋亡蛋白Bax隨著肉桂醛的濃度,表達(dá)量也隨之增加,而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)量則呈現(xiàn)下降趨勢(shì),肉桂醛誘導(dǎo)惡性腫瘤細(xì)胞的凋亡指數(shù)Bax/Bcl-2呈現(xiàn)出劑量依賴性。第六節(jié)肉桂醛對(duì)Trx抗氧化系統(tǒng)Trx和TrxR蛋白表達(dá)的影響利用Western Blot檢測(cè)肉桂醛介導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌SPC-A1細(xì)胞Trx抗氧化系統(tǒng)Trx和TrxR蛋白表達(dá)水平。肉桂醛作用于SPC-A1細(xì)胞后,胞內(nèi)的硫氧還蛋白Trx和硫氧還蛋白還原酶TrxR的表達(dá)水平呈現(xiàn)劑量依賴性上升,該結(jié)果證明了肉桂醛能激活Trx系統(tǒng),從而導(dǎo)致胞內(nèi)活性氧的積累,啟動(dòng)凋亡程序。第三章基于腫瘤靶向性分布的氨基酸為載體的藥物ZT-6、8、9的設(shè)計(jì)合成基于氨基酸為腫瘤組織靶向性分布的載體,分別以天冬氨酸二叔丁基鹽酸鹽、瓜氨酸叔丁基鹽酸鹽、天冬酰胺叔丁基鹽酸鹽與草酰氯單乙酯為原料,采用液相合成法,發(fā)生�；�耦合,酸性環(huán)境下脫去叔丁基保護(hù)基團(tuán),設(shè)計(jì)合成具有腫瘤靶向性的化合物ZT-6、8、9。經(jīng)高效液相色譜、氫譜、碳譜和質(zhì)譜等技術(shù)確認(rèn)其分子量及化學(xué)結(jié)構(gòu),檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)與原設(shè)計(jì)目標(biāo)化合物相吻合。綜上所述,本研究的結(jié)果顯示,肉桂醛可以抑制肺癌細(xì)胞SPC-A-1的增值,而且其抗癌作用與通過線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑,通過阻滯細(xì)胞周期的S期影響腫瘤細(xì)胞的有絲分裂,激活抗氧化系統(tǒng)Trx系統(tǒng)引起胞內(nèi)活性氧ROS水平的積累,隨后激活促凋亡基因Bax和抑制抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá),發(fā)揮綜合作用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究系統(tǒng)地研究了肉桂醛的抗癌作用,并闡明了其部分作用機(jī)制,為進(jìn)一步評(píng)估肉桂醛的成藥性開發(fā)新藥奠定了基礎(chǔ)。另外,本研究設(shè)計(jì)了并成功合成了新化合物ZT-6、8、9,其純度均達(dá)到96%以上,通過改善純化工藝,獲得了純度高于97%的白色固體粉末。
【學(xué)位授予單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R284;R285
【圖文】：

胖、糖尿病、代謝性疾病等提供了可行的治療方法。，瓜氨酸在一定作用下釋放出NO，體內(nèi)NO是在一氧化氮合酶由精氨酸分解生成的，瓜氨酸是該反應(yīng)的副產(chǎn)物。瓜氨酸通過精氨酸琥珀酸合成成酶(AS)及精氨酸代琥珀酸裂解酶(AL)重即瓜氨酸-NO循環(huán)[70]。張一文等[71]發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液中加入精氨酸,可瓜氨酸代替精氨酸，亦可出現(xiàn)NO的合成。胺是人體必需氨基酸，是蛋白質(zhì)組成之一，在體內(nèi)，天冬酰胺化下分謝成天冬氨酸及氨基。在機(jī)體缺氧時(shí)，天冬酰胺能轉(zhuǎn)換成草酰乙酸，參與三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生大量的能量。另外，天冬前體物質(zhì)，是在谷草轉(zhuǎn)氨酶、二氫吡咯-5-羧酸合成酶（P5CS共同作用下完成的。鳥氨酸是鳥氨酸循環(huán)中重要的組成部分，轉(zhuǎn)移酶生成瓜氨酸，進(jìn)而在精氨酸代琥珀酸合成酶生成精氨NOS 催化生成 NO[72]。

圖 2 Trx 系統(tǒng)的酶促反應(yīng)[92]Fig.2 Enzymatic reactions of the thioredoxin system[92]細(xì)胞內(nèi) Trx 系統(tǒng)作為氧化還原調(diào)節(jié)劑，通過消除 ROS 來保護(hù)細(xì)胞免受過高的 ROS 引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)，維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原動(dòng)態(tài)平衡。TRX 系統(tǒng)在許多生理過程，作為細(xì)胞抗氧化劑發(fā)揮著重要的作用[93]。相比正常細(xì)胞，癌細(xì)胞存在線粒體結(jié)構(gòu)上的差異與缺陷，通常需要消耗更多的能量來維持不受限的增殖及逃避細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致胞內(nèi)的活性氧水平升高，胞內(nèi)抗氧化蛋白也表達(dá)上調(diào)。相比正常細(xì)胞，在許多原發(fā)腫瘤中，TRX 系統(tǒng)蛋白過表達(dá)，促進(jìn)惡性細(xì)胞的增殖[94]。在細(xì)胞質(zhì)和線粒體中，存在著豐富的 Trx 系統(tǒng)只要抑制任何一個(gè)系統(tǒng)都能激活細(xì)胞凋亡信號(hào)通路。目前，已經(jīng)有一部分 Trx 或者 TrxR 抑制劑被列為腫瘤化療候選藥物用來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。辛二酰苯異羥肟酸（SAHA）通過上調(diào) Trx 系統(tǒng)的內(nèi)源性抑制劑來抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。其他靶向

圖 4 肉桂醛對(duì) SPC-A1 細(xì)胞生長抑制的影響Fig.4 Cinnamaldehyde inhibit growth of SPC-A1 cell in vitro. Cell proliferation wassessed with MTT assay. Columns represent mean values while error bars representSEM(n=3)(*P<0.05,**p<0.01 vs Control group)4 實(shí)驗(yàn)討論MTT 法是一種較為常見檢測(cè)細(xì)胞存活和增殖的實(shí)驗(yàn)方法�；罴�(xì)胞線粒的琥珀酸脫氫酶能外源性的 MTT 還原生成不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Form二甲基亞砜（DMSO）是一種“萬能溶劑”，能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)檢測(cè)儀在 570 nm 波長處測(cè)定光吸收值，在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT 結(jié)晶形數(shù)量與細(xì)胞數(shù)成正比，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。該方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于大規(guī)腫瘤藥物的篩選，此方法具有靈敏性高和經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)。本章實(shí)驗(yàn)是采用 MTT 法來檢測(cè)肉桂醛對(duì)人肺癌 SPC-A1 細(xì)胞增殖的影

【參考文獻(xiàn)】

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3 李冬冬;陶遵威;;靶向硫氧還蛋白系統(tǒng)抗腫瘤藥物的研究進(jìn)展[J];天津藥學(xué);2014年04期

4 李嬌妹;鄭紡;翟麗娟;薛照輝;;三萜類化合物抗腫瘤活性研究進(jìn)展[J];中草藥;2014年15期

5 吳俊蘭;盧斌;肖菊香;;硫氧還蛋白系統(tǒng)與腫瘤的關(guān)系[J];現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué);2012年11期

6 毛健;馬海樂;;靈芝多糖的研究進(jìn)展[J];食品科學(xué);2010年01期

7 張國欽;王寧;王濤;祝偉星;曲宸緒;邢秀梅;;北京市城區(qū)居民煙草消費(fèi)和大氣污染對(duì)肺癌死亡率的影響[J];環(huán)境與健康雜志;2009年08期

8 周薇;胡世蓮;;氨基酸與腫瘤[J];中國臨床保健雜志;2007年02期

9 郭愛平;李蘇宜;;免疫營養(yǎng)與抗腫瘤治療的研究進(jìn)展[J];臨床腫瘤學(xué)雜志;2006年04期

10 唐任光;一氧化氮與消化道腫瘤[J];右江民族醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2005年03期

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本文編號(hào)：2745610