發(fā)布時(shí)間：2020-07-07 19:09

【摘要】：研究背景及目的:大氣污染是影響公眾健康的首要環(huán)境危險(xiǎn)因素,我國(guó)已經(jīng)成為世界上大氣污染最嚴(yán)重的國(guó)家之一,研究大氣污染的危害性和防治方法成為社會(huì)和健康的迫切需要。大氣PM2.5(particulate matter,2.5)是指空氣動(dòng)力學(xué)直徑等于或小于2.5微米的顆粒物,既可以通過(guò)引起肺部炎癥進(jìn)而造成全身炎癥性反應(yīng),也可以進(jìn)入血液循環(huán)進(jìn)而直接影響全身多個(gè)器官,與包括慢性阻塞性肺疾病、動(dòng)脈粥樣硬化(aterosclerosis,AS)和代謝綜合征在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。AS的發(fā)生發(fā)展與PM2.5對(duì)血管內(nèi)皮功能損傷、脂質(zhì)浸潤(rùn)、慢性炎癥等有關(guān)。PM2.5作用于人體,其所含有的水溶性成分、酸溶性成分會(huì)刺激人體釋放一系列的炎癥因子誘發(fā)炎癥反應(yīng),導(dǎo)致AS斑塊的進(jìn)展;同時(shí)氧自由基的表達(dá)增多,使細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài),功能下降,可引發(fā)細(xì)胞凋亡以及多種心血管疾病的發(fā)生。白藜蘆醇(resveratrol,RES)是從中藥虎杖中提取的一種多酚類物質(zhì),具有廣泛的藥理作用,尤其在抗氧化、抗炎及治療心血管系統(tǒng)疾病方面作用明顯。本實(shí)驗(yàn)從白藜蘆醇對(duì)PM2.5誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞凋亡和炎癥因子表達(dá)的影響展開(kāi)研究,探討白藜蘆醇的保護(hù)作用及其機(jī)制,為白藜蘆醇用于治療和預(yù)防PM2.5導(dǎo)致的心血管疾病及其相關(guān)并發(fā)癥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:1.白藜蘆醇對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞活性的保護(hù)效果:培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞EA.hy926,給予PM2.5加或不加白藜蘆醇處理,采用CCK-8法檢測(cè)白藜蘆醇預(yù)處理對(duì)PM2.5誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞活性的影響。2.白藜蘆醇對(duì)PM2.5誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的保護(hù)作用:取血管內(nèi)皮細(xì)胞EA.hy926,分為陰性對(duì)照組、PM2.5組(PM2.5終濃度為100 u g · mL-1)、PM2.5+NAC 組(PM2.5 終濃度為 100 μ g · mL-1 NAC 終濃度為 10 μ mol · L-1)、PM2.5+RES組(PM2.5終濃度為100μg·mL-1,RES終濃度分別為5、10、20μmol · L-1)。通過(guò)H2DCF-DA熒光探針?lè)?觀察各組細(xì)胞胞內(nèi)R0S含量的變化:采用Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)法標(biāo)記細(xì)胞,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況;采用Western blot法檢測(cè)亡相關(guān)蛋白(Cytochrome C、Caspasc 3、Caspase 9、PARP)表達(dá)及活化的情況。3.PM2.5對(duì)IL-8表達(dá)的影響及白藜蘆醇干預(yù)研究;(1)首先設(shè)置分組為陰性對(duì)照組、PM2.5 組(終濃度為 100 u g · mL-1)、SB203580+PM2.5 組(PM2.5 終濃度為 100μ g · mL-1,SB203580 終濃度為 25 μ mol · L-1)、SP600125+PM2.5 組(PM2.5 終濃度為100 μ g · mL-1,SP600125終濃度為25 μ mol · L 1),用qRT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞因子IL-8 mRNA表達(dá)情況,分析PM2.5對(duì)IL-8表達(dá)的影響及其信號(hào)通路;(2)白藜蘆醇干預(yù)作用:實(shí)驗(yàn)分為陰性對(duì)照組、PM2.5組、PM2.5+不同濃度RES組,刺激24h后用qRT-PCR法檢測(cè)EA.hy926細(xì)胞IL-8 mRNA的表達(dá)情況;(3)白藜蘆醇作用的相關(guān)信號(hào)通路:用 Western blot 檢測(cè) p38 MAPK 及 Phospho-p38 MAPK 蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果:1.與陰性對(duì)照組比較,5、10、20 μ mol·L-1 RES組細(xì)胞活性無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);當(dāng)濃度為50、100、200 μ g · mL-1 PM2.5組時(shí)可以抑制細(xì)胞活性(p0.05,p0.01),我們選擇100μg·mL-1作為后續(xù)試驗(yàn)的有效干預(yù)濃度;用不同濃度白藜蘆醇預(yù)處理2h后細(xì)胞活性明顯增高,與PM2.5(100 μ g · mL-1)組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05,0.01)。2.與陰性對(duì)照組比較,PM2.5(100μg·mL-1)可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS生成增多、細(xì)胞凋亡(p0.01),并使凋亡相關(guān)蛋白 Cytochrome C、Caspase 3、Caspase 9、PARP 表達(dá)增高或活化;與PM2.5(100μ g · mL-1)組比較,白藜蘆醇及NAC預(yù)處理能顯著抑制PM2.5誘導(dǎo)的ROS生成及細(xì)胞凋亡,同時(shí)可見(jiàn)Cytochrome C表達(dá)下調(diào)和Caspase 3、Caspase 9、PARP 活化減少。3.與陰性對(duì)照組比較,PM2.5(100μg·mL-1)組IL-8 mRNA表達(dá)明顯升高(p0.01);與PM2.5組比較,加入p38 MAPK信號(hào)通路抑制劑SB20380后IL-8 mRNA的表達(dá)下降并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,加入JNK信號(hào)通路抑制劑SP600125對(duì)IL-8 mRNA表達(dá)無(wú)明顯影響;不同濃度的白藜蘆醇預(yù)處理可顯著下調(diào)IL-8 mRNA的表達(dá)(p0.05,p0.01);Western blot結(jié)果顯示,在PM2.5刺激后Phospho-p38蛋白顯著上升(p0.01);而用10,20μmol·L-1白藜蘆醇預(yù)處理可顯著下調(diào)Phospho-p38蛋白的表達(dá)(p0.01)。結(jié)論:1.PM2.5能對(duì)EA.hy926細(xì)胞有明顯毒性;白藜蘆醇預(yù)處理可顯著抑制PM2.5對(duì)EA.hy926細(xì)胞的毒性,發(fā)揮保護(hù)作用。2.PM2.5可導(dǎo)致EA.hy926細(xì)胞氧自由基生成增多,凋亡細(xì)胞比例及凋亡蛋白表達(dá)升高;而白藜蘆醇預(yù)處理可顯著降低PM2.5誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞凋亡,這一保護(hù)作用可能是通過(guò)減少細(xì)胞內(nèi)ROS的生成發(fā)揮作用的。3.PM2.5可通過(guò)激活p38 MAPK信號(hào)通路誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞IL-8 mRNA的表達(dá);白藜蘆醇預(yù)處理可顯著降低PM2.5引起的EA.hy926細(xì)胞IL-8 mRNA的表達(dá),這可能是通過(guò)干預(yù)p38 MAPK信號(hào)通路發(fā)揮作用的。
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285
【圖文】：

２．邋３．邋５結(jié)果逡逑２．邋３．邋５．邋１邋ＰＭ２．邋５影響ＥＡ．邋ｈｙ９２６細(xì)胞ＩＬ－８邋ｒａＲＮＡ表達(dá)的信號(hào)通路逡逑圖１１結(jié)果顯示，ＰＭ２．邋５刺激后細(xì)胞炎性因子ＩＬ－８邋ｍＲＮＡ表達(dá)水平明顯升高，與陰逡逑性對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（／？〈0．邋０１）；與ＰＭ２．邋５組比較，ＳＢ２０３５８０組（ＳＢ）邋ＩＬ－８逡逑的ｍＲＮＡ表達(dá)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，并且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（；？＜０．邋０５）邋；邋ＳＰ６００１２組（ＳＰ）ＩＬ－８逡逑的ｍＲＮＡ表達(dá)呈現(xiàn)與預(yù)期相反的趨勢(shì)，沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義＞０．０５）。這表明，ＰＭ２．邋５逡逑可能通過(guò)ｐ３８邋ＭＡＰＫ信號(hào)通路導(dǎo)致炎性因子ＩＬ－８邋ｍＲＮＡ表達(dá)水平上升。逡逑１０－１逡逑８－邐＆＆邐ｎ￣ｍｌｉ邋ｒｍ逡逑６邋Ｍ逡逑°？逡逑 ２－邋＝＝■■逡逑Ｊｌ邐，邋Ｉ邐，邐１１１１１１１１１１１逡逑Ｏ邐ｐｍ２．５邐ＳＢ邐ＳＰ逡逑濃度均為２邋５ｐｉｒｉｏ卜Ｌ／１逡逑ＰＭ２．５（邋Ｉ邋００邋Ｍｇ＇邋ｎｉＬ＇１）逡逑注：與對(duì)照組比較，＜０．０５；與ＰＭ２．邋５組比較，＞＜０．０５。逡逑圖１１白藜蘆醇對(duì)ＰＭ２．邋５導(dǎo)致的ＥＡ．邋ｈｙ９２６細(xì)胞丨Ｌ－８邋ｍＲＮＡ表達(dá)信號(hào)通路的影響逡逑（ｎ＝３）逡逑Ｆｉｇ．１１邋Ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏＩ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｓｉｇｎａｌ邋ｐａｔｈ邋ｏｆ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ＩＬ￣８邋ｍＲＮＡ逡逑ｉｎ邋ＰＭ２．５￣ｉｎｄｕｃｅｄ邋ＥＡ．邋ｈｙ９２６邋ｃｅｌｌｓ逡逑２．邋３．邋５．邋２白藜蘆醇對(duì)ＰＭ２．邋５導(dǎo)致的ＥＡ．邋ｈｙ９２６細(xì)胞炎性因子ＩＬ－８表達(dá)的影響逡逑結(jié)果如圖１２所示

ｉｎ邋ＰＭ２．５￣ｉｎｄｕｃｅｄ邋ＥＡ．邋ｈｙ９２６邋ｃｅｌｌｓ逡逑２．邋３．邋５．邋２白藜蘆醇對(duì)ＰＭ２．邋５導(dǎo)致的ＥＡ．邋ｈｙ９２６細(xì)胞炎性因子ＩＬ－８表達(dá)的影響逡逑結(jié)果如圖１２所示，ＰＭ２．邋５刺激后細(xì)胞炎性因子比－８邋ｍＲＮＡ表達(dá)明顯升高，與陰性逡逑對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〈０．０１），而白藜蘆醇預(yù)處理可以使ＩＬ－８邋ｍＲＮＡ逡逑表達(dá)下降，與ＰＭ２．邋５組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（／ｐ邋＜０．０５，邐＜０．０１）。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，逡逑不同濃度的白藜蘆醇預(yù)處理可顯著下調(diào)ＩＬ－８邋ｍＲＮＡ的表達(dá)。結(jié)合圖１１的結(jié)果，我們逡逑分析白藜蘆醇可以下調(diào)ＰＭ２．邋５誘導(dǎo)的ＥＡ．邋ｈｙ９２６細(xì)胞ＩＬ－８邋ｍＲＮＡ表達(dá)，可能通過(guò)干預(yù)逡逑ｐ３８邋ＭＡＰＫ信號(hào)通路發(fā)揮作用，我們將結(jié)合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行下…步的實(shí)驗(yàn)研究。逡逑２８逡逑

５０邐ＰＭ２．５邐５邐１０邐２０逡逑｜，．１邋c坼危ǎ停恚錚戾澹桑�」）辶x希校停玻��擔(dān)ㄥ澹保埃板澹停櫻у澹恚蹋В保╁義隙哉兆楸冉希�［E埃�０�擔(dān)揮耄校停玻�邋５组比较，ｖ堝［E埃�０�擔(dān)�［E埃�０１。辶x限悸�醇�(jí)裕校停玻�邋�滌盞嫉模牛粒�邋ｈｙ９２�斷赴�ＩＬ－８邋�潁簦椋遙危簾澩锏撓跋歟ǎ睿劍澹悖翦澹錚駑澹潁澹螅觶澹潁幔簦潁錚戾澹錚鑠澹簦瑁邋澹澹�７w潁澹螅螅椋錚鑠澹錚駑澹桑蹋�８邋ｍ＿b危鈴澹椋鑠澹校停玻�邋�擔(dān)�ｉＥＡ．ｈｙ９２６邋ｃｅ�歟歟簀義下�醇�(jí)裕校停玻�邋�檔賈碌模穡常稿澹停粒校誦藕磐�路中相关蛋皧y澩锏撓跋戾義希螅簦澹潁鑠澹猓歟錚舴�检测７w常稿澹停粒校思埃校瑁錚螅穡瑁錚擼穡常稿澹停粒校說(shuō)鞍妝澩銼洌蕩碳ぃ牛粒�邋ｈｙ９２�斷赴�后，ＰｈｅP螅穡瑁錚�３８／７w常傅鞍妝澩鎪�茲蚕阴须s型臣蒲б庖澹ǎ繡澹

本文編號(hào)：2745499