發(fā)布時間：2020-07-04 04:18

【摘要】：成纖維細(xì)胞生長因子9(FGF9)是FGFs家族中的一種分泌型蛋白,由間皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞分泌,具有骨骼發(fā)育、組織修復(fù)、毛發(fā)再生等多種生物學(xué)活性。FGF9的研究從癌癥、骨骼相關(guān)疾病、性腺分化等的透徹機(jī)理機(jī)制到骨關(guān)節(jié)炎治療、促進(jìn)毛發(fā)生長與創(chuàng)傷修復(fù)的作用機(jī)理,臨床應(yīng)用及需求的逐步加大。植物油體融合技術(shù)的廣泛應(yīng)用,且紅花作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥物蛋白已成為研究熱點(diǎn)。本實驗通過紅花表達(dá)oleosin-rhFGF9重組蛋白,獲得穩(wěn)定遺傳的紅花植株,進(jìn)行生物學(xué)活性和初步藥效學(xué)分析,主要研究結(jié)果如下:1.通過凍融法將鑒定的pOTBar-oleosin-rhFGF9質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中,農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將oleosin-rhFGF9基因轉(zhuǎn)入紅花子葉中,經(jīng)紅花組織培養(yǎng)、Basta篩選獲得轉(zhuǎn)基因再生苗,嫁接法,PCR驗證,擴(kuò)繁,獲得轉(zhuǎn)基因T_3紅花種子。2.通過Western blot定性分析及ELISA定量分析,oleosin-rhFGF9融合蛋白含量為0.13%。MTT法檢測生物學(xué)活性,濃度為60 ng·mL~(-1)時,轉(zhuǎn)基因紅花油體促NIH/3T3細(xì)胞增殖較好,且有一定劑量依賴性。3.建立C57BL/6小鼠脫發(fā)模型,小鼠毛發(fā)生長狀況及HE染色、新生毛發(fā)數(shù)表明各組小鼠毛發(fā)長勢良好,其中高劑量組小鼠毛發(fā)濃密,陽性組促進(jìn)毛發(fā)生長效果類似,新生毛發(fā)數(shù)均較空白組有顯著效果;免疫組織化學(xué)染色和皮膚組織總蛋白的WB分析,表明高劑量組、陽性組的β-catenin表達(dá)較空白組有顯著性差異,與毛發(fā)生長狀況呈一定相關(guān)性。4.建立C57BL/6小鼠創(chuàng)傷模型,小鼠創(chuàng)口愈合情況,HE染色,Masson染色及創(chuàng)口愈合率表明各組小鼠創(chuàng)傷愈合明顯,陽性組、高劑量組、低劑量組愈合效果較空白組均顯著,且在第5 d,高劑量組愈合效果顯著優(yōu)于陽性組。
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5
【圖文】：

箱中培養(yǎng) 24 h。根據(jù) ELASA 定量的結(jié)果，選取轉(zhuǎn)基因及野生型紅花種子 2-3 粒中提取油體，先將種子用 75%酒精進(jìn)行表面消毒處理，使用的 PBS 緩沖液、手棒、離心管等均為滅菌消毒，離心法提取純化獲得紅花種子油體蛋白。用 DE體蛋白，設(shè)陽性孔（bFGF 標(biāo)準(zhǔn)品）、野生型紅花油體總蛋白孔及轉(zhuǎn)基因紅花油體，按 0.94~120 ng·mL-1各 9 個濃度倍比稀釋，每孔加 100 μL，可設(shè)復(fù)孔。96 孔板細(xì)胞依照如上所述進(jìn)行上樣，于 37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 48 h。取出 96 孔板入配制好的 20 μL MTT（5 g·L-1）溶液混勻，培養(yǎng) 4 h 后，棄掉培養(yǎng)基，每孔加 O，振蕩混勻，酶標(biāo)儀測量 570/630 nm 處的吸光度。結(jié)果 農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化鑒定pOTBar-oleosin-rhFGF9 質(zhì)粒通過凍融法轉(zhuǎn)入 EHA105 農(nóng)桿菌感受態(tài)中，28℃培平板上長出的單菌落，搖菌，PCR 驗證，1%瓊脂糖凝膠電泳見圖 1.1，如圖所道有條帶，且條帶位置與陽性對照一致，空白對照的 2 號泳道處沒有條帶，Bar-oleosin-rhFGF9 質(zhì)粒已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)。

圖 1.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的紅花轉(zhuǎn)化流程Fig.1.2 Agrobacterium mediated transformation of safflower發(fā)；B.農(nóng)桿菌侵染；C.共培養(yǎng)；D.芽分化；E.再生苗；F.砧木和接穗；G.嫁接；H.練基因紅花的 PCR 檢測no Drop 測定紅花植株基因組濃度為 200-400 ng·μL-1，A260/A280 均在 量較好。紅花基因組作為模板，進(jìn)行 PCR 反應(yīng)，瓊脂糖凝膠電泳分析， 14 株與陽性對照一致的條帶，空白對照和陰性對照均無條帶，其中 6 個條轉(zhuǎn)化紅花子葉 1752，轉(zhuǎn)化率為 0.8%。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前8條

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相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

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本文編號：2740624