發(fā)布時(shí)間：2020-07-03 22:16

【摘要】：研究背景及目的動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)被看作是導(dǎo)致急性心腦血管事件發(fā)生發(fā)展最主要的病因,其核心病理表現(xiàn)為富含脂質(zhì)的斑塊,目前尚缺乏可快速穩(wěn)定和消退斑塊的措施。根據(jù)中醫(yī)理論,AS屬于痰瘀互結(jié)的范疇,脈絡(luò)被腹中之痰濁所阻塞后,日久營(yíng)血瘀滯,就此形成痰濁瘀血相凝之結(jié)塊。本課題組前期實(shí)驗(yàn)證實(shí):“痰瘀同治”方藥(下文簡(jiǎn)稱(chēng)復(fù)方中藥)可有效抑制AS的進(jìn)展,但機(jī)制與他汀不同。已知膽汁酸腸肝循環(huán)是體內(nèi)膽固醇代謝的關(guān)鍵環(huán)節(jié),重吸收的膽汁酸是機(jī)體生成膽固醇的重要前體,故經(jīng)腸道重吸收入血的膽汁酸也可被視為“腑中之痰濁”。我們前期研究發(fā)現(xiàn):復(fù)方中藥干預(yù)AS模型小鼠后,可顯著抑制膽汁酸的重吸收,加速其自糞便排出,同時(shí)保持末端回腸粘膜結(jié)構(gòu)完整。故此,本研究目的在于探究“痰瘀同治”方藥?kù)畛�腹中痰濁抑制AS發(fā)生和發(fā)展的新機(jī)制,為傳統(tǒng)中醫(yī)藥防治心腦血管疾病提供新策略和新方法。研究方法1、人結(jié)腸腺癌Caco-2單層細(xì)胞模型建立及評(píng)價(jià):于Transwell細(xì)胞小室內(nèi)接種Caco-2細(xì)胞,培養(yǎng)至21天,此過(guò)程中通過(guò)不同時(shí)間點(diǎn)連續(xù)監(jiān)測(cè)跨上皮細(xì)胞電阻(transepithelial electrical resistance,TEER)和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性的變化來(lái)明確單層細(xì)胞構(gòu)建成功,將細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照組、膽汁酸刺激組及復(fù)方中藥預(yù)干預(yù)+膽汁酸刺激組。2、復(fù)方中藥對(duì)Caco-2細(xì)胞膽汁酸吸收的影響:1)復(fù)方中藥對(duì)膽汁酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)作用的研究:通過(guò)柱前衍生反相高效液相色譜法(reverse phase high-performance liquid chromatography,RP-HPLC)定量分析各組Caco-2單層細(xì)胞模型對(duì)膽汁酸的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)情況;2)復(fù)方中藥對(duì)膽汁酸吸收作用機(jī)制的研究:基于上述細(xì)胞模型,各組給予不同處理后,通過(guò)qRT-PCR和Western Blot定量分析細(xì)胞內(nèi)膽汁酸吸收相關(guān)基因mRNA及蛋白的表達(dá)水平。3、復(fù)方中藥對(duì)Caco-2單層細(xì)胞模型屏障功能及細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的影響:1)復(fù)方中藥對(duì)Caco-2細(xì)胞屏障功能保護(hù)作用的研究:在上述Caco-2細(xì)胞模型中,各組給予不同處理后,評(píng)估各組熒光染料滲透率和TEER的變化,分析上述干預(yù)對(duì)Caco-2單層細(xì)胞滲透性的影響;隨后通過(guò)qRT-PCR和Western Blot分析細(xì)胞間緊密連接相關(guān)基因mRNA及蛋白表達(dá)水平的變化;2)復(fù)方中藥對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激水平影響的研究:通過(guò)熒光探針?lè)ê土魇郊?xì)胞術(shù)定量分析上述Caco-2單層細(xì)胞模型中ROS的生成以及凋亡的差異。研究結(jié)果1、Caco-2單層細(xì)胞模型的建立及評(píng)價(jià):Transwell小室內(nèi)培養(yǎng)Caco-2細(xì)胞9天時(shí)TEER值已達(dá)到(510.93±44.54)Ω·cm~2,當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至19天和21天時(shí),TEER值顯著高于500Ω·cm~2的模型建立標(biāo)準(zhǔn)。Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)至8天時(shí),單層細(xì)胞頂端(apical side,AP)ALP活性與底端(basolateral side,BL)相比顯著升高(P0.05),當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至19天與21天時(shí),Transwell小室兩側(cè)ALP活性的比值進(jìn)一步擴(kuò)大,達(dá)到2.68:1、3.44:1。2、復(fù)方中藥抑制膽汁酸吸收的作用機(jī)制研究:1)與相應(yīng)的膽汁酸刺激組相比,復(fù)方中藥預(yù)處理可以顯著降低膽酸(cholic acid,CA)、甘氨膽酸(glycocholic acid,GCA)以及�；悄懰�(taurocholic acid,TCA)在Transwell細(xì)胞小室下室中的濃度(P0.05),但對(duì)DCA無(wú)顯著作用(P0.05);2)究其機(jī)制而言,復(fù)方中藥預(yù)處理可對(duì)抗CA、GCA以及TCA三者導(dǎo)致的Caco-2細(xì)胞頂端鈉依賴(lài)性膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(apical sodium dependent bile acid transporter,ASBT)、有機(jī)溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體β(organic solute transporter,OSTβ)mRNA及蛋白表達(dá)水平的升高(P0.05),但對(duì)回腸膽汁酸結(jié)合蛋白(ileal bile acid binding protein,IBABP)的mRNA表達(dá)無(wú)顯著影響(P0.05);復(fù)方中藥預(yù)處理對(duì)脫氧膽酸(deoxycholic acid,DCA)刺激所引起的ASBT和OSTβmRNA及蛋白表達(dá)水平的改變無(wú)顯著影響(P0.05),但可對(duì)抗IBABP mRNA表達(dá)水平的下降(P0.05);復(fù)方中藥預(yù)處理可對(duì)抗GCA以及TCA所導(dǎo)致的OSTαmRNA表達(dá)水平的升高(P0.01),但對(duì)CA、DCA無(wú)顯著影響(P0.05),提示:復(fù)方中藥可有效抑制Caco-2細(xì)胞對(duì)膽汁酸的吸收,但對(duì)于不同膽汁酸其抑制作用和機(jī)制有所差異。3、復(fù)方中藥對(duì)腸道上皮細(xì)胞屏障功能保護(hù)作用的研究:1)與單純膽汁酸刺激組相比,復(fù)方中藥預(yù)處理可顯著抑制CA、DCA以及GCA導(dǎo)致的細(xì)胞滲透性增加(P0.05)以及TEER值的降低(P0.05),上述保護(hù)作用伴隨緊密連接蛋白中咬合蛋白(occludin,Ocln)和閉鎖小帶蛋白2(zonula occluden 2,ZO2)mRNA及蛋白表達(dá)水平的顯著上調(diào)(P0.05),但對(duì)TCA刺激所導(dǎo)致的改變無(wú)顯著影響(P0.05);2)在閉合蛋白1(claudin 1,Cldn1)mRNA的調(diào)控方面,復(fù)方中藥預(yù)處理可顯著改善GCA和TCA導(dǎo)致的表達(dá)降低(P0.01),但對(duì)CA和DCA的病理作用無(wú)顯著影響(P0.05);在ZO1 mRNA的調(diào)控方面,復(fù)方中藥預(yù)處理可顯著改善DCA、GCA和TCA導(dǎo)致的表達(dá)降低(P0.01),但對(duì)CA無(wú)顯著影響(P0.05);3)復(fù)方中藥預(yù)處理可顯著降低CA、DCA和GCA刺激所誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平增高(P0.05)以及細(xì)胞凋亡(P0.01),但對(duì)TCA無(wú)顯著影響(P0.05)。提示:復(fù)方中藥可提供一定的腸道黏膜的保護(hù)作用,其對(duì)抗不同膽汁酸的保護(hù)作用以及機(jī)制有所差異。研究結(jié)論本研究在前期動(dòng)物在體實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討復(fù)方中藥抑制膽汁酸吸收及改善腸道上皮細(xì)胞屏障功能作用的機(jī)制,揭示了:1)復(fù)方中藥可以有效抑制腸道上皮細(xì)胞對(duì)膽汁酸的吸收,該作用可能主要是通過(guò)下調(diào)ASBT和OSTβ基因mRNA及蛋白的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn),其是復(fù)方中藥抑制膽汁酸吸收的潛在作用靶點(diǎn);2)復(fù)方中藥能夠顯著對(duì)抗膽汁酸所引起的腸道屏障功能失調(diào),上述保護(hù)作用可能主要是通過(guò)調(diào)節(jié)緊密連接蛋白Ocln和ZO2的表達(dá)以及抑制細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平和凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)。綜上所述,復(fù)方中藥可通過(guò)抑制膽汁酸在腸道的重吸收及維持腸道上皮細(xì)胞屏障功能,即祛除“腑中之痰濁”,從而發(fā)揮其降脂抗AS的作用。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R285
【圖文】：

痰瘀同治方藥抑制人結(jié)腸腺癌 Caco-2 細(xì)胞膽汁酸吸收的機(jī)制研究（三）統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用 SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( x±s)表示，滿足正態(tài)分布且方差齊性者采用單因素方差分析，偏態(tài)分布者采用秩和檢驗(yàn)。P<0.05或 P<0.01 時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果（一）Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)倒置相差顯微鏡下觀察接種 3 天后的 Caco-2 細(xì)胞，形態(tài)正常，均勻鋪展，可見(jiàn)清晰的細(xì)胞輪廓，貼壁良好，大部分細(xì)胞已成島，融匯率達(dá)到 80%以上，懸浮細(xì)胞數(shù)量較少，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，未見(jiàn)空泡，高倍鏡下未觀察到細(xì)菌、真菌污染現(xiàn)象。

位論文aco-2單層細(xì)胞完整性swell 小室內(nèi)培養(yǎng)的 Caco-2 細(xì)胞，隨著時(shí)間的推移單層細(xì)細(xì)胞培養(yǎng)至第 9 天時(shí) TEER 值已達(dá)到(510.93±44.54) Ω· 21 天時(shí)，TEER 值達(dá)到了(737.2±47.77) Ω·cm2和(765o-2 單層細(xì)胞完整性和緊密性已經(jīng)形成，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要：

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 錢(qián)小奇;試論高脂血癥的病因病機(jī)[J];天津中醫(yī);2002年06期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 李奇恒;痰瘀同治方藥調(diào)節(jié)膽汁酸腸肝循環(huán)的機(jī)制研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2017年

本文編號(hào)：2740252