發(fā)布時(shí)間：2020-07-03 21:31

【摘要】：潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種炎癥性腸道疾病,全球發(fā)病率不斷增加,研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)生、發(fā)展與炎癥密切相關(guān)。猴頭菇是藥食兩用真菌,傳統(tǒng)應(yīng)用于治療消化道疾病�；�于猴頭菌對(duì)胃腸道的保護(hù)作用,本課題嘗試從猴頭發(fā)酵菌絲體中分離純化得到猴頭多糖,對(duì)多糖的抗炎活性和治療小鼠UC的效果進(jìn)行評(píng)價(jià),并探究其作用機(jī)制。主要研究工作如下:(1)猴頭發(fā)酵菌絲體中多糖的分離、純化和結(jié)構(gòu)初步表征。首先將猴頭菌絲體粉末經(jīng)水提醇沉、除蛋白后得到猴頭粗多糖,總糖含量為89.1%,凝膠滲透色譜結(jié)果顯示猴頭粗多糖的重均分子量(Mw)為22.3 kDa(8.60%)、18.7 kDa(61.77%)、2.2 kDa(29.63%)。因此進(jìn)一步選擇離子交換柱DEAE-Sepharose Fast Flow和葡聚糖凝膠柱Sephadex G-75分離純化,得到單一組分HEP10(polypolysaccharides of Hericium erinaceus 10),其Mw為9.9 kDa,是由葡萄糖(69.2%)、半乳糖(14.7%)、鼠李糖(5.2%)、木糖(4.7%)、氨基半乳糖(2.0%)、甘露糖(1.7%)、巖藻糖(1.6%)、氨基葡萄糖(0.9%)8種單糖組成的雜多糖。IR、1H NMR和13C NMR結(jié)果顯示HEP10是由α和β型糖苷鍵連接的吡喃糖組成,推測(cè)糖苷鍵連接方式為(1→2)和(1→6)。(2)HEP10體外抗炎活性評(píng)價(jià)。通過(guò)1μg/mL脂多糖(LPS)作用于巨噬細(xì)胞RAW264.7建立體外炎癥模型,將不同濃度HEP10作用于炎癥細(xì)胞模型20 h,考察HEP10的抗炎活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),濃度為12.5-400μg/mL HEP10作用細(xì)胞,對(duì)細(xì)胞存活率無(wú)顯著影響。當(dāng)HEP10濃度為50-200μg/mL時(shí),其對(duì)NO分泌產(chǎn)生了明顯的抑制作用,同時(shí)抑制白細(xì)胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α的分泌,并下調(diào)TNF-α、IL-1β基因轉(zhuǎn)錄水平,對(duì)IL-6分泌及其mRNA表達(dá)沒(méi)有顯著影響。25-200μg/m LHEP10能夠顯著下調(diào)由LPS刺激的細(xì)胞中誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)和環(huán)氧合酶(COX)-2的表達(dá),抑制炎癥小體胱冬肽酶(Caspase)-1、NOD樣受體(NLRP)3、凋亡相關(guān)微粒蛋白(ASC)的激活;Western Blot結(jié)果顯示,HEP10顯著下調(diào)NF-κB、PI3K/Akt和MAPK信號(hào)通路中相關(guān)蛋白的磷酸化水平,抑制信號(hào)通路激活。(3)HEP10治療葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)小鼠UC的機(jī)制研究。采用2%DSS誘導(dǎo)C57BL/6小鼠建立UC動(dòng)物模型,評(píng)價(jià)HEP10對(duì)小鼠UC的治療效果。結(jié)果顯示,與模型組相比,不同劑量HEP10(50、100和200 mg/kg/d)治療組均能改善小鼠體重下降、疾病指數(shù)評(píng)分增加的情況,結(jié)腸長(zhǎng)度分別增長(zhǎng)了23.7%、29.1%和40.9%。病理切片結(jié)果顯示,HEP10(50、100和200 mg/kg/d)治療組小鼠的結(jié)腸中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象改善,隱窩與腺體結(jié)構(gòu)完整,病理炎癥程度減輕。氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)顯示,治療組小鼠中血清NO含量分別下降13.4%、26.5%和36.4%,結(jié)腸丙二醛(MDA)水平分別下降了21.4%、47.3%和56.4%,同時(shí)結(jié)腸髓過(guò)氧化物酶(MPO)的酶活降低,總超氧化物歧化酶(T-SOD)的酶活明顯增加。qRT-PCR和Western Blot顯示,HEP10(50、100和200 mg/kg/d)降低小鼠結(jié)腸中炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌及其mRNA的相對(duì)表達(dá)水平,下調(diào)炎癥蛋白i NOS和COX-2的表達(dá)量,抑制炎癥小體NLRP3、ASC和Caspase-1的激活并下調(diào)NF-κB、PI3K/Akt和MAPK中相關(guān)蛋白的磷酸化水平,從而抑制炎癥相關(guān)信號(hào)通路的激活。綜上所述,猴頭多糖HEP10具有抗炎活性,可以改善小鼠UC的炎癥癥狀,其作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)改善組織損傷,并抑制炎癥小體激活,下調(diào)炎癥相關(guān)信號(hào)通路中蛋白的磷酸化水平,調(diào)控炎癥因子基因轉(zhuǎn)錄,降低炎癥因子和蛋白的表達(dá)量,從而減緩組織炎癥的發(fā)展。
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285.5
【圖文】：

HECP)，得率為18.2%。2.4.2 猴頭粗多糖中總糖含量葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2-1所示，利用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖樣品中總糖含量，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算可得，猴頭粗多糖中總糖含量為89.1%。

圖 2-1 苯酚-硫酸法測(cè)總糖含量的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 2-1 Glucose standard curve by Phenol - Sulfuric Acid m白含量蛋白，隨著次數(shù)增加，蛋白含量降低，同時(shí)多vage 試劑重復(fù)三次除蛋白，既可最大程度去除利用 Bradford 法測(cè)定蛋白含量，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖粗多糖中蛋白含量為 6.3%。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2740201