發(fā)布時(shí)間：2020-07-03 15:27

【摘要】：研究表明在概念、臨床范疇、發(fā)病條件等方面,情志與心理應(yīng)激有著很多的相似性,情志致病學(xué)說(shuō)與心理應(yīng)激反應(yīng)有著本然的一致性。隨著2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus,T2DM)發(fā)病率在全國(guó)乃至全球范圍內(nèi)的逐年升高,心理應(yīng)激與糖尿病發(fā)病的相關(guān)性越來(lái)越引起人們的關(guān)注。心理應(yīng)激能提高糖耐量減低者發(fā)展成糖尿病的機(jī)率。糖尿病可引起大腦認(rèn)知功能紊亂,表現(xiàn)出輕、中度的認(rèn)知障礙以及學(xué)習(xí)記憶能力的下降,這種疾病即為糖尿病認(rèn)知功能障礙(Diabetes-Associated Cognitive Decline,DACD),嚴(yán)重者可發(fā)展為阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)。目前尚未發(fā)現(xiàn)DACD的特征性神經(jīng)病理改變,多項(xiàng)研究表明其發(fā)病機(jī)制和病理學(xué)改變與AD相似。研究發(fā)現(xiàn)AD患者和動(dòng)物腦內(nèi)均發(fā)生蛋白質(zhì)泛素化,依賴于E3連接酶,慢性心理應(yīng)激通過(guò)增加泛素化及降解,能夠引起認(rèn)知功能損傷。提示情志所致的DACD可能與腦內(nèi)蛋白質(zhì)泛素化有關(guān)。此外,研究還發(fā)現(xiàn)慢性心理應(yīng)激可使腸道內(nèi)致病菌增加,有益菌減少等。腸道菌群的失調(diào)可導(dǎo)致T2DM及其并發(fā)癥認(rèn)知功能障礙的發(fā)生發(fā)展。蛋白質(zhì)組學(xué)能夠在整體水平上對(duì)基因組表達(dá)的全部蛋白質(zhì)進(jìn)行大規(guī)模研究,進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)的研究可加快對(duì)疾病病理改變的認(rèn)識(shí)�，F(xiàn)在對(duì)于DACD的蛋白質(zhì)組學(xué)研究還很淺,對(duì)其泛素化蛋白質(zhì)組學(xué)方面的分析更少,而多個(gè)針對(duì)AD的研究已經(jīng)證實(shí)了蛋白質(zhì)泛素化在AD等神經(jīng)退行性疾病中具有重要作用。因此,DACD腦內(nèi)泛素化蛋白質(zhì)組學(xué)研究將有助于理解其發(fā)病機(jī)理。平衡的腸道菌群不僅在宿主的新陳代謝中發(fā)揮關(guān)鍵作用,而且還可以形成一個(gè)天然屏障,抵御外來(lái)病原菌的侵襲。一旦腸道菌群的平衡被打破,則宿主表現(xiàn)為疾病易感性。人體許多疾病如T2DM的發(fā)生發(fā)展都與腸道菌群的失調(diào)有關(guān)系,腸道菌群在T2DM的發(fā)生與轉(zhuǎn)歸中扮演著重要角色。近年來(lái)大量研究還發(fā)現(xiàn)腸道菌群的改變與認(rèn)知行為之間存在明顯的相關(guān)性。腸道菌群的改變會(huì)影響宿主的行為,比如認(rèn)知功能損傷、抑郁和焦慮等。目前仍然沒(méi)有公認(rèn)的治療DACD的有效措施。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為DACD屬于“消渴”合并“健忘”或“呆癥”。在多年臨床經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,戰(zhàn)麗彬教授依據(jù)清代·吳澄《不居集》中記載的資成湯加味而成滋補(bǔ)脾陰方藥(ZiBu PiYin Recipe,ZBPYR)。該方不僅能改善臨床患者健忘、呆癥等認(rèn)知障礙的癥狀,而且還能改善脾陰虛癡呆大鼠、老齡大鼠、自發(fā)性糖尿病肥胖大鼠(Zucker Diabetic Fatty Rats,ZDF)大鼠、高脂喂養(yǎng)聯(lián)合鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)注射誘發(fā)的糖尿病大鼠以及db/db小鼠的認(rèn)知功能。綜上,本研究一是觀察ZDF大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的行為學(xué)表現(xiàn)及情志應(yīng)激是否促進(jìn)了DACD的發(fā)生發(fā)展;二是基于非標(biāo)記定量Label-free聯(lián)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)的泛素化蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)以及生物信息學(xué)分析找尋腦內(nèi)和情志應(yīng)激所致DACD發(fā)病、ZBPYR干預(yù)作用緊密相關(guān)的泛素化蛋白質(zhì)和生物學(xué)通路,以期為研究情志應(yīng)激所致DACD的發(fā)病機(jī)制以及ZBPYR的治療機(jī)制提供新線索;此外,基于16S rRNA技術(shù),我們動(dòng)態(tài)觀察了情志應(yīng)激所致DACD及ZBPYR干預(yù)后發(fā)生發(fā)展過(guò)程中腸道菌群的變化,闡明ZBPYR對(duì)腸道菌群的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)作用。一、理論研究本章較為系統(tǒng)地對(duì)情志與DACD的相關(guān)性進(jìn)行了探討分析,對(duì)中醫(yī)學(xué)、現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)DACD的認(rèn)識(shí)及治療的現(xiàn)有研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié),同時(shí)對(duì)“從脾論治”ZBPYR治療DACD的理論、情志應(yīng)激所致DACD動(dòng)物模型的建立進(jìn)行多方面、多層次、多方向的探討,為“脾主思藏意”,“思傷脾、脾失藏意”引起DACD的理論內(nèi)涵和基礎(chǔ)研究提供支撐和依據(jù)。本章研究為論文的設(shè)計(jì)和系統(tǒng)研究提供基礎(chǔ)。二、實(shí)驗(yàn)研究目的:1.觀察ZBPYR對(duì)情志應(yīng)激所致DACD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響;2.對(duì)情志應(yīng)激所致DACD大鼠全腦組織進(jìn)行泛素化蛋白質(zhì)組學(xué)研究以尋找出差異表達(dá)的泛素化蛋白質(zhì);3.差異表達(dá)的泛素化蛋白質(zhì)用于生物信息學(xué)分析,以期了解與DACD發(fā)病密切相關(guān)的生物學(xué)通路和蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò),并分析ZBPYR的可能作用靶點(diǎn);4.闡明泛素化蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果的可靠性,并初步分析差異表達(dá)的泛素化蛋白質(zhì)豐度改變與mRNA水平變化的關(guān)系;5.動(dòng)態(tài)觀察情志應(yīng)激所致DACD大鼠腸道菌群的變化及ZBPYR的調(diào)節(jié)作用。方法:瘦型同窩大鼠(Lean Zucker rat,LZ)為對(duì)照組,自發(fā)性2型糖尿病模型ZDF大鼠隨機(jī)分為糖尿病模型組(ZDF)、糖尿病模型+情志組(ZDF_P)、糖尿病模型+情志+滋補(bǔ)脾陰方藥治療組(P_Z),共4組。1.通過(guò)監(jiān)測(cè)隨機(jī)血糖(Random blood glucose,RBG)、空腹血清胰島素(Fasting serum insulin,FSI)、口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(Oral glucose tolerance,OGTT)和胰島素耐量實(shí)驗(yàn)(Insulin tolerance,ITT),觀察4組大鼠的糖尿病狀態(tài)和ZBPYR的干預(yù)作用。通過(guò)檢測(cè)皮質(zhì)酮,觀察各組大鼠下丘腦-垂體-腎上腺軸(Hypothalamic-pituitary-adrenal,HPA)是否被激活。2.通過(guò)行為學(xué)實(shí)驗(yàn),包括曠場(chǎng)、避暗以及水迷宮實(shí)驗(yàn),觀察4組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力和ZBPYR的干預(yù)作用。3.利用Label-free聯(lián)合LC-MS/MS技術(shù)進(jìn)行泛素化蛋白質(zhì)組學(xué)分析,篩選差異表達(dá)的泛素化蛋白質(zhì)。4.通過(guò)GO分類注釋、KEGG通路和蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò),對(duì)差異表達(dá)的泛素化蛋白質(zhì)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。5.在蛋白水平上,利用Western blotting技術(shù)驗(yàn)證泛素化蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)果可靠性;利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(Quantitative Real-time PCR,qPCR)初步分析差異表達(dá)的泛素化蛋白質(zhì)豐度改變和mRNA水平變化的關(guān)系。6.基于16S rRNA技術(shù)進(jìn)行腸道菌群分析,分析腸道菌群物種的豐度和多樣性,尋找ZBPYR作用的腸道菌群靶點(diǎn)。結(jié)果:1.ZDF組大鼠每周的RBG均明顯升高,葡萄糖機(jī)能受損,存在糖耐量異常和外周胰島素抵抗;情志應(yīng)激加重了大鼠的葡萄糖機(jī)能受損和外周胰島素抵抗;給予ZBPYR治療后,大鼠葡萄糖耐量得到改善,外周胰島素抵抗減輕。情志應(yīng)激顯著升高了大鼠的皮質(zhì)酮水平,ZBPYR治療能夠顯著降低其水平。2.在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中,ZBPYR治療顯著升高了大鼠的正中格停留時(shí)間、中央格穿梭以及直立次數(shù),有增加大鼠運(yùn)動(dòng)總距離的趨勢(shì)。在避暗實(shí)驗(yàn)中,ZBPYR治療有延長(zhǎng)大鼠潛伏期的趨勢(shì)。在Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)中,接受ZBPYR治療后的P_Z組大鼠訓(xùn)練第5天的潛伏期明顯縮短。在Morris水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)中,ZBPYR治療有增加大鼠尋找原平臺(tái)所在位置的時(shí)間、在原平臺(tái)所在象限停留時(shí)間及穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)的趨勢(shì)。在Morris水迷宮可視化平臺(tái)實(shí)驗(yàn)中,4組大鼠的游泳距離和尋找可見(jiàn)平臺(tái)的潛伏期比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。3.共鑒定到1,680個(gè)泛素化位點(diǎn),1,620個(gè)泛素化肽段,842個(gè)泛素化蛋白質(zhì)。與LZ組比較,在ZDF組發(fā)現(xiàn)56個(gè)上調(diào)及144個(gè)下調(diào)的差異表達(dá)泛素化蛋白質(zhì);與ZDF組比較,在ZDF_P組發(fā)現(xiàn)69個(gè)上調(diào)及58個(gè)下調(diào)的差異表達(dá)泛素化蛋白質(zhì);與ZDF_P組比較,在P_Z組發(fā)現(xiàn)52個(gè)上調(diào)及124個(gè)下調(diào)的差異表達(dá)泛素化蛋白質(zhì)。此外,在上述兩兩比較中,發(fā)現(xiàn)16個(gè)共同差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。4.生物信息學(xué)方法:差異表達(dá)泛素化蛋白質(zhì)主要位于細(xì)胞、細(xì)胞器以及細(xì)胞膜;細(xì)胞過(guò)程、單生物過(guò)程、生物調(diào)節(jié)、多細(xì)胞生物過(guò)程和代謝過(guò)程是其參與的主要生物學(xué)過(guò)程。LZ組和ZDF組的差異表達(dá)蛋白質(zhì)主要參與的KEGG通路有10條,包括胰島素分泌、胰腺分泌、cAMP信號(hào)通路等;ZDF組和ZDF_P組的差異表達(dá)蛋白質(zhì)主要參與的KEGG通路有11條,包括cAMP信號(hào)通路、心肌細(xì)胞中的腎上腺素能信號(hào)、胰島素分泌等;ZDF_P組和P_Z組的差異表達(dá)蛋白質(zhì)主要參與的KEGG通路有21條,包括內(nèi)吞作用、多巴胺能突觸、cAMP信號(hào)通路等。通過(guò)使用IntACT數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)LZ組與ZDF組、ZDF組與ZDF_P組、ZDF_P組與P_Z組分別存在79、51、59個(gè)相互作用的差異表達(dá)蛋白質(zhì)。5.通過(guò)使用Western blotting技術(shù)驗(yàn)證選取的鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ型亞基 α(Calcium/calmodulin-dependent protein kinase type Ⅱ subunit alpha,Camk2α)、鈉/鉀轉(zhuǎn)運(yùn) ATP 酶亞基 β-1(Sodium/potassium-transporting ATPase subunit beta-1,Atp1b1)、鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白G(o)亞基α(Guanine nucleotide-binding protein G(o)subunit alpha,Gnao1)、磷酸丙糖異構(gòu)酶 1(Triosephosphate isomerase,Tpi1)4個(gè)差異表達(dá)泛素化蛋白質(zhì),其結(jié)果與泛素化蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)果一致。qPCR結(jié)果表明,ZDF組Camk2α mRNA表達(dá)較LZ組明顯降低,P_Z組Camk2α mRNA表達(dá)較ZDF_P組顯著上調(diào)。Atp1b1 mRNA、Gnao1 mRNA、Tpi1 mRNA的表達(dá)變化與蛋白質(zhì)水平變化趨勢(shì)相一致,但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。6.腸道菌群分析:微生物群落α多樣性指數(shù)結(jié)果顯示,給予ZBPYR可動(dòng)態(tài)降低Chao1、ACE指數(shù)。在門水平上,所有樣品以厚壁菌門和擬桿菌門為主,且豐度隨時(shí)間的變化發(fā)生了動(dòng)態(tài)變化。在屬水平上,各組樣品中優(yōu)勢(shì)菌屬為乳酸桿菌屬;薩特氏菌屬、羅氏菌屬、雙歧桿菌屬、鏈球菌屬、普雷沃菌屬、乳酸桿菌屬等隨時(shí)間的變化菌屬豐度發(fā)生了動(dòng)態(tài)變化。樣品主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)、主坐標(biāo)分析(Principal Coordinate Analysis,PCoA)和UniFrac距離組間/組內(nèi)差異比較分析能夠看出ZDF組、ZDF_P組樣品與LZ組樣品很好地分離,而P_Z組樣品分布于ZDF組與ZDF_P組之間,表明ZBPYR可調(diào)節(jié)DACD大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)。結(jié)論:1.自發(fā)性糖尿病肥胖ZDF大鼠符合DACD的行為學(xué)改變,是良好的DACD動(dòng)物模型。情志應(yīng)激促進(jìn)和加重了DACD的發(fā)生發(fā)展。ZBPYR除了能改善DACD大鼠的RBG升高等糖尿病特征外,還可提高學(xué)習(xí)記憶能力。情志應(yīng)激激活了ZDF大鼠的HPA軸,ZBPYR能夠抑制HPA軸的激活。2.應(yīng)用Label-free聯(lián)合LC-MS/MS的蛋白質(zhì)非標(biāo)記定量技術(shù),構(gòu)建了LZ大鼠和ZDF大鼠的泛素化蛋白質(zhì)圖譜,奠定了深入研究蛋白質(zhì)泛素化與DACD相關(guān)性的基礎(chǔ);發(fā)現(xiàn)200個(gè)差異表達(dá)泛素化蛋白質(zhì)與DACD發(fā)病相關(guān),127個(gè)差異表達(dá)泛素化蛋白質(zhì)與情志應(yīng)激相關(guān),以及可能是ZBPYR作用的16個(gè)差異表達(dá)泛素化蛋白質(zhì)靶點(diǎn)。3.生物信息學(xué)分析闡明了大鼠全腦組織中差異表達(dá)泛素化蛋白質(zhì)的GO分類、KEGG通路和蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)相互作用,為DACD發(fā)病機(jī)制的基礎(chǔ)研究和ZBPYR的治療機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。4.通過(guò)使用Western blotting技術(shù)證實(shí)了本次實(shí)驗(yàn)中泛素化蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的可靠性。qPCR結(jié)果提示蛋白質(zhì)表達(dá)水平的改變可能不完全源于mRNA的變化。5.腸道菌群分析結(jié)果表明ZBPYR能顯著性改善失調(diào)的腸道菌群多樣性并動(dòng)態(tài)降低Chao1、ACE多樣性指數(shù)。人和大鼠微生物在門的組成上是相同的。從動(dòng)態(tài)發(fā)展過(guò)程看,ZBPYR可升高乳酸桿菌屬、嗜黏蛋白阿克曼氏菌屬、Anaerostipes屬豐度;可降低Allobaculum、另枝菌屬、變形桿菌屬、糞球菌屬豐度。ZBPYR能顯著調(diào)節(jié)情志應(yīng)激所致DACD引起的益生菌和致病菌紊亂。
【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285.5
【圖文】：

＿Ｚ逡逑組大鼠有降低的趨勢(shì)（表丨－２和圖１－２Ａ）。ＦＳ丨水平在４組間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表逡逑１－３邋和圖邋１－２Ｂ）。逡逑表邋１－２邋大鼠邋ＲＢＧ邋（邋ｘ土ｓ，ｍｍｏｌ／Ｌ）逡逑分組第１周第２周第３周第４周邋第５周邋第６周邋第７周邋第８周逡逑３８逡逑

圖２．１－１各組大鼠樣品的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳圖逡逑Ｆ大鼠全腦泛素化蛋白質(zhì)組學(xué)的鑒定結(jié)果逡逑質(zhì)譜定量分析及ｍａｘｑｕａｎｔ查庫(kù)來(lái)獲得樣本的肽段豐度信息。以ｐｒｏｔｅ０．０１，ｐｅｐｔｉｄｅ邋ＦＤＲ彡０．０１為篩選條件對(duì)結(jié)果進(jìn)行過(guò)濾。最終鑒定至ｌｊｌ，６化位點(diǎn)，１，６２０個(gè)泛素化肽段，８４２個(gè)泛素化蛋白。逡逑ｅ邋Ｏｎｔｏｌｏｇｙ邋分析逡逑ｎｅ邋Ｏｎｔｏｌｏｇｙ（簡(jiǎn)稱ＧＯ）可用來(lái)全面描述生物體中基因和基因產(chǎn)物的屬數(shù)據(jù)庫(kù)中有３個(gè)獨(dú)立的本體（Ｏｎｔｏｌｏｇｙ）：生物學(xué)過(guò)程（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ邋Ｐｒｏｃｅｓｓ分（ＣｅｌｌｕｌａｒＣｏｍｐｏｎｅｎｔ）、分子功能（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＦｕｎｃｔｉｏｎ）。逡逑本研究中，通過(guò)Ｐｒｏｔｅｏｍｅ邋Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ軟件，懫用ＧＯ分類注釋（ｌｅｖｅｌ邋的泛素化蛋白質(zhì)。對(duì)于３個(gè)本體（生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分、分子功能）的條目，將所有相應(yīng)泛素化的蛋白質(zhì)個(gè)數(shù)列出，并做出餅狀統(tǒng)計(jì)圖２．１－２．１－４。ＧＯ分類圖顯示了邋３個(gè)本體中所涉及到各條目的分布情況，并以標(biāo)記各個(gè)條目。逡逑

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