發(fā)布時間：2020-07-03 04:06

【摘要】：目的:我們的前期實驗已證明芒果甙(mangiferin,MA)可上調(diào)小鼠脾臟單個核細胞(mononuclear cells,MNCs)中調(diào)節(jié)性B細胞(regulatory B cells,Bregs)和白細胞介素10(interleukin 10,IL-10)水平,本次研究在此基礎(chǔ)上,進一步探究MA上調(diào)Bregs和IL-10的分子機制,為MA運用于慢性移植物抗宿主病(chronic graft-versus-host disease,cGVHD)防治提供分子依據(jù)。方法:通過頸椎脫臼法處死雄性BALB/c小鼠后,用紅細胞裂解液分離出小鼠脾臟MNCs。首先檢驗MA是否可以激活JAK2-STAT3、ERK、及TLR4-MyD88三條信號通路,在此部分研究中,實驗分組如下:(1)DMSO對照組;(2)實驗組:用不同濃度MA(50uM、100uM、150uM、200uM)干預小鼠脾臟MNCs,用Western blot法檢測各組細胞中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、ERK、p-ERK、TLR4、MyD88等分子的蛋白表達量,用RT-PCR檢測各組細胞中TLR4的轉(zhuǎn)錄水平。然后,分別在抑制劑存在的條件下,驗證MA激活以上信號通路是否影響B(tài)regs增殖分化和IL-10的分泌,實驗分組如下:(1)DMSO對照組;(2)200uM MA組;(3)200uM MA+抑制劑組(JAK2激活抑制劑AG490,或STAT3激活抑制劑HO3867,或ERK激活抑制劑U0126),在證明抑制劑有效的前提下,用ELISA檢測各組細胞培養(yǎng)上清液中IL-10的濃度,用流式細胞術(shù)檢測各組細胞中Bregs的比例。結(jié)果:1、MA通過激活JAK2-STAT3信號通路促進IL-10表達,但Bregs的增殖分化不受該信號通路影響:(1)MA激活JAK2-STAT3信號通路。與對照組相比,MA呈劑量依賴性促進p-JAK2、p-STAT3蛋白表達,尤以200uM MA組增高最明顯(P=0.000,P=0.008),但不影響JAK2、STAT3的蛋白表達(P0.05)。(2)AG490、HO3867可抑制MA對JAK2-STAT3信號通路的激活作用。Western blot結(jié)果顯示,與MA組相比,MA+抑制劑組(AG490或HO3867)p-JAK2、p-STAT3的蛋白表達量顯著減少(AG490:P_(p-JAK2)=0.043,P_(p-STAT3)=0.016;HO3867:P_(p-STAT3)=0.001)。(3)AG490、HO3867抑制MA上調(diào)MNCs中IL-10表達的作用。ELISA結(jié)果顯示,與MA組相比,MA+抑制劑組(AG490或HO3867)IL-10的濃度明顯降低(AG490:P=0.0057;HO3867:P=0.0333),但流式細胞術(shù)結(jié)果顯示兩組Bregs水平并無差異(P0.05)。2、MA通過激活ERK信號通路促進小鼠MNCs中負性調(diào)節(jié)因子IL-10的蛋白表達水平,但Bregs的增殖分化不受該通路影響:(1)MA上調(diào)ERK通路水平。與對照組相比,各組MA均可顯著提高p-ERK的蛋白水平(P=0.045、0.016、0.103、0.047),但不影響ERK的蛋白表達(P0.05)。(2)U0126抑制MA對ERK的磷酸化。Western blot結(jié)果顯示,與MA組相比,MA+U0126組p-ERK蛋白表達量顯著減少(P=0.0079)。(3)U0126抑制MA對MNCs細胞IL-10分泌的促進作用。ELISA結(jié)果顯示,與MA組相比,MA+U0126組IL-10的水平明顯降低(P=0.0046),但流式細胞術(shù)顯示的Bregs水平兩組之間并無差異(P0.05)。3、MA可能通過激活TLR4-MyD88信號通路,促進小鼠MNCs中Bregs增殖和IL-10產(chǎn)生:(1)RT-PCR結(jié)果顯示,與對照組相比,MA明顯上調(diào)了MNCs中TLR4的轉(zhuǎn)錄水平(P=0.042、0.114、0.02、0.031);Western blot結(jié)果也顯示,MA可促進MNCs表達TLR4(P=0.049、0.09、0.003、0.001)、MyD88(P_(100uM)=0.036)。結(jié)論:本研究對既往實驗結(jié)果進行了補充和延伸,證實MA通過激活JAK2-STAT3和ERK兩條信號通路上調(diào)小鼠脾臟MNCs中IL-10的表達,這為MA可能發(fā)揮的抗cGVHD作用提供了分子依據(jù);然而,本次研究并未發(fā)現(xiàn)MA促進Bregs增殖的分子機制,以及芒果甙的體內(nèi)活性等一系列問題也有待進一步深入研究,以期為cGVHD的防治提供新的治療方案。
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5
【圖文】：

20圖 1. MA 激活小鼠脾臟 MNCs 中 JAK2-STAT3 信號通路注：小鼠脾臟 MNCs 在 DMSO 組及不同濃度 MA（50uM、100uM、150uM、200uM）組的條件下培養(yǎng) 72h，用 Western Blot 法檢測細胞中 JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 蛋白表達水平，MA 組 p-JAK2、p-STAT3 的蛋白表達水平均明顯升高，而JAK2、STAT3 的表達水平較對照組無明顯變化。*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001,MA v.s. DMSO

華 中 科 技 大 學 碩 士 學 位 論 文圖 2. JAK2 激活抑制劑 AG490 可抑制 MA 對 JAK2-STAT3 的激活作用注：小鼠脾臟 MNCs 分別在 DMSO、200uM MA、及 200uM MA+50uM AG490條件下體外培養(yǎng) 72h，用 Western Blot 法檢測細胞中 JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 蛋白表達水平。 *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, MA v.s. DMSO,MA+AG490 v.s. MA

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