發(fā)布時(shí)間：2020-07-01 17:18

【摘要】：山楂葉是常用的中藥之一,現(xiàn)代藥理研究表明山楂葉及其制劑在心腦血管疾病方面具有很好的療效。中藥山楂系薔薇科山楂屬和蘋果屬幾種植物成熟果實(shí)的通稱。品種來(lái)源復(fù)雜,供藥用的主要有薔薇科山楂屬的山楂Crataegus pinnatifida Bge.、山里紅Crataegus pinnatifida Bge.Var.Major N.E.Br、野山楂Crataegus Sieb.et Zucc.、云南山楂Crataegus scabrifolia(Franch.)Rehd.(云山楂)等,以及蘋果屬的臺(tái)灣林檎Malus doumeri(Bois)Chev、光萼林檎Species M.doumeri(Bois)Chev.(廣山楂)等。2015版中國(guó)藥典收載的山楂葉為薔薇科植物山里紅Crataegus pinnatifida Bge.Var.Major N.E.Br.或山楂Crataegus pinnatifida Bge.的干燥葉,商品名俗稱北山楂葉。除了中國(guó)藥典收載的山楂葉外,部分省份還習(xí)用云山楂葉和廣山楂葉,廣山楂葉在廣西等地使用已久,并且被收錄于1990版《廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)》。經(jīng)查閱文獻(xiàn),北山楂葉與廣山楂葉中均含有黃酮類和有機(jī)酸類成分,但其種類和含量有較大的差別�；瘜W(xué)成分的不同會(huì)引起藥理及臨床療效的差異。為了更合理的使用山楂葉,充分發(fā)揮其臨床療效,本實(shí)驗(yàn)對(duì)33批中國(guó)藥典收載的山楂葉和8批產(chǎn)于廣東、廣西省的廣山楂葉質(zhì)量進(jìn)行系統(tǒng)的比較分析。山楂葉的質(zhì)量控制方法現(xiàn)多采用高效液相法(HPLC-DAD)對(duì)單個(gè)或多個(gè)成分進(jìn)行含量測(cè)定以及指紋圖譜研究。HPLC法存在著分離時(shí)間長(zhǎng),靈敏度低等不足,而超高效液相色譜法(UPLC)具有快速、靈敏、分離度高等優(yōu)點(diǎn)。另外,液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)技術(shù)能夠?qū)⒁合嗌�譜的高分離能力與質(zhì)譜的強(qiáng)大結(jié)構(gòu)測(cè)定功能相結(jié)合,在中藥化學(xué)成分研究中有著廣泛的應(yīng)用,通過(guò)對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)的采集和分析,可以對(duì)含量低、分離效果差及紫外吸收弱等不適宜用HPLC-DAD進(jìn)行測(cè)定的成分進(jìn)行定性、定量檢測(cè)。鑒于此,本研究擬采用UPLC法代替HPLC法對(duì)北山楂葉和廣山楂葉進(jìn)行指紋圖譜比較研究,通過(guò)主成分和聚類分析分別建立北山楂葉和廣山楂葉的指紋圖譜共有模式,并完成5種已知成分的同步測(cè)定;同時(shí)采用LC-MS技術(shù)結(jié)合對(duì)照品和文獻(xiàn)對(duì)山楂葉中部分成分進(jìn)行化學(xué)成分識(shí)別;定量方面采用LC-MS法,采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)增加對(duì)含量低、分離效果差等,不適宜用UPLC-DAD檢測(cè)的表兒茶素、山楂葉苷A和蘆丁的含量測(cè)定,完成北山楂葉和廣山楂葉中8種成分的含量測(cè)定。綜上,本研究從定性、化學(xué)成分、定量等方面對(duì)北山楂葉和廣山楂葉進(jìn)行系統(tǒng)比較分析,從而闡明不同產(chǎn)地山楂葉的異同,為臨床上合理用藥提供理論依據(jù)。第一部分不同產(chǎn)地北山楂葉與廣山楂葉UPLC指紋圖譜研究及多組分含量測(cè)定目的:采用UPLC法分別建立北山楂葉和廣山楂葉UPLC指紋圖譜共有模式,同時(shí)對(duì)各產(chǎn)地山楂葉中所共有的綠原酸、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、金絲桃苷5種成分進(jìn)行含量測(cè)定,從定性和定量方面對(duì)北山楂葉和廣山楂葉進(jìn)行比較分析。方法:采用UPLC法,采用Waters CORTECS UPLC C18色譜柱(3.0 mm×100mm,1.6μm),以乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)為流動(dòng)相,梯度洗脫,T:0~4~7~14~16~25~28~30 min,A(12%~12%~17%~17%~25%~40%~80%~80%),B(88%~88%~83%~83%~75%~60%~20%~20%),流速0.2 m L·min-1,檢測(cè)波長(zhǎng)320 nm,柱溫30℃,進(jìn)樣量3μL,分別建立北山楂葉和廣山楂葉UPLC指紋圖譜,標(biāo)定指紋共有峰,通過(guò)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版》進(jìn)行指紋圖譜相似度評(píng)價(jià),然后,以共有峰的峰面積為變量,運(yùn)用SPSS數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件通過(guò)聚類分析、主成分分析,分別建立北山楂葉與廣山楂葉指紋圖譜共有模式。相同條件下,測(cè)定不同產(chǎn)地北山楂葉與廣山楂葉中5種成分的含量。結(jié)果:1建立33批北山楂葉指紋圖譜,標(biāo)定出8個(gè)共有峰,33批樣品與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度為:0.171~0.985。2通過(guò)系統(tǒng)聚類分析和主成分分析,33批北山楂葉樣品被聚為3類:S2~S21、S23~S31、S33為第Ⅰ類,S1、S32為第Ⅱ類,S22為第Ⅲ類。3剔除了峰數(shù)目和峰面積相差較大的第Ⅱ、Ⅲ類3批樣品,選取第Ⅰ類S2~S21、S23~S31、S33共30批樣品建立北山楂葉指紋圖譜共有模式,標(biāo)定10個(gè)共有峰,通過(guò)相似度評(píng)價(jià),30批樣品與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度為0.835~0.989。4建立8批廣山楂葉指紋圖譜,標(biāo)定出20個(gè)共有峰,通過(guò)相似度評(píng)價(jià),8批樣品與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度為:0.923~0.977。5相同色譜條件下,采用外標(biāo)法,測(cè)定出33批北山楂葉和8批廣山楂葉樣品中綠原酸、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、金絲桃苷的含量。結(jié)論:通過(guò)聚類和主成分分析后所建立的30批北山楂葉指紋圖譜共有模式和8批廣山楂葉指紋圖譜準(zhǔn)確、可靠,同時(shí)測(cè)定了5種成分的含量。從UPLC指紋圖譜和多組分定量方面對(duì)北山楂葉和廣山楂葉進(jìn)行了分析比較。第二部分山楂葉LC-MS化學(xué)成分分析目的:采用LC-MS技術(shù)結(jié)合已知對(duì)照品和參考文獻(xiàn),推斷部分有機(jī)酸,黃酮類的裂解,對(duì)山楂葉中化學(xué)成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析,為山楂葉研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。方法:色譜條件:同第一部分的色譜條件;質(zhì)譜條件:采用Triple TOFTM 5600質(zhì)譜檢測(cè)器,運(yùn)用ESI源,分別在正、負(fù)離子模式下確定質(zhì)譜參數(shù)為:質(zhì)量范圍100-1000 m/z;源溫度600℃;霧化氣50 psi;輔助氣50 psi;氣簾氣35 psi;源內(nèi)電壓5500 V(正離子模式)、-4500 V(負(fù)離子模式)。結(jié)果:通過(guò)質(zhì)譜碎片信息結(jié)合對(duì)照品和文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)對(duì)山楂葉中部分成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析,采用Triple TOFTM 5600質(zhì)譜檢測(cè)器鑒定了山楂葉中11個(gè)成分。結(jié)論:通過(guò)高分辨質(zhì)譜對(duì)山楂葉部分化學(xué)成分進(jìn)行鑒別,為山楂葉研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。第三部分基于HPLC-MS的不同產(chǎn)地北山楂葉與廣山楂葉多組分含量測(cè)定目的:采用LC-MS技術(shù)增加含量低、分離度差等的表兒茶素、山楂葉苷A和蘆丁的檢測(cè),同時(shí)對(duì)綠原酸、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、蘆丁、金絲桃苷進(jìn)行含量測(cè)定,增加北山楂葉與廣山楂葉定量研究指標(biāo)。方法:液相條件:采用HPLC,運(yùn)用Agilent Poroshell 120 SB-C18(2.1mm×100 mm,2.7μm)色譜柱,以0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)梯度洗脫:T:0~10~25~35~40~45~55 min,A(90%~88%~80%~80%~40%~20%~10%),B(10%~18%~20%~20%~60%~80%~90%),檢測(cè)波長(zhǎng)320nm;流速0.15 m L·min-1;柱溫30℃;進(jìn)樣量1μL。質(zhì)譜條件:采用Agilent 6310質(zhì)譜檢測(cè)器,ESI源,MRM,負(fù)離子模式,質(zhì)譜參數(shù)為:質(zhì)量范圍100-700 m/z;源溫度350℃;氮?dú)鈮毫?0 psi;干燥氣流速10 L·min-1;電壓3750 V。結(jié)果:通過(guò)采用LC-MS方法,結(jié)合MRM模式,共測(cè)定33批北山楂葉和8批廣山楂葉中表兒茶素、綠原酸、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、山楂葉苷A、蘆丁、金絲桃苷8種成分的含量。結(jié)論:本研究增加了北山楂葉與廣山楂葉定量檢測(cè)指標(biāo),所建立的LC-MS法測(cè)定北山楂葉與廣山楂葉中8種成分的含量準(zhǔn)確、可靠,從定量方面為評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地北山楂葉質(zhì)與廣山楂葉質(zhì)量提供理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：承德醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R284.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2737057