發(fā)布時(shí)間：2020-07-01 07:24

【摘要】：目的:急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)后導(dǎo)致的心力衰竭(heart failure,HF),因其發(fā)生伴隨著嚴(yán)重的并發(fā)癥和高死亡率,成為目前心血管領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。AMI后心室重構(gòu)(ventricular remodeling,VR)被認(rèn)為是引發(fā)HF的主要病理基礎(chǔ),因此,減輕AMI后的VR是治療HF不容忽視的重要干預(yù)環(huán)節(jié)�，F(xiàn)有治療藥物雖在臨床上得到廣泛應(yīng)用,但其藥效與安全性仍不甚滿意。中醫(yī)藥在改善HF方面具有明顯改善HF患者活動(dòng)度、提高生存質(zhì)量的特點(diǎn),且用藥安全性高,因而成為尋找HF新的治療藥物的重要領(lǐng)域。本研究以補(bǔ)氣名方保元湯(Baoyuan decoction,BYD)為研究對(duì)象,擬以調(diào)控血管緊張素Ⅱ1型受體(angiotensin Ⅱ type 11receptor,AT1)-心肌錨定重復(fù)蛋白(cardiac ankyrin repeat protein,CARP)通路為關(guān)鍵切入點(diǎn),利用冠狀動(dòng)脈左前降支(left anterior descending,LAD)結(jié)扎術(shù)制備AMI后HF動(dòng)物模型,結(jié)合Ang Ⅱ刺激制備心肌細(xì)胞凋亡及肥大模型,進(jìn)一步構(gòu)建pcDNA3.1-Ankrd1質(zhì)粒并進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染制備過表達(dá)CARP細(xì)胞模型,從整體離體兩個(gè)層面闡釋保元湯抑制AMI后HF心肌細(xì)胞凋亡以及肥大等心室重構(gòu)環(huán)節(jié)的藥理機(jī)制。方法:1.采用LAD結(jié)扎術(shù)制備AMI后HF動(dòng)物模型,分為假手術(shù)組,模型組,保元湯組,陽性對(duì)照藥物福辛普利鈉片組。于術(shù)后連續(xù)灌胃給藥28d,對(duì)保元湯抗AMI后HF心肌細(xì)胞凋亡與肥大兩大環(huán)節(jié)的主要藥效指標(biāo)進(jìn)行研究:采用超聲心動(dòng)評(píng)價(jià)各組大鼠心功能;利用血生化檢測(cè)測(cè)定各組大鼠血清中肌酸激酶(creatine kinase,CK)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)的含量;采用酶聯(lián)免疫(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法檢測(cè)血漿中心鈉肽(atrial natriuretic peptide,ANP)、腦鈉肽(brain natriuretic peptide,BNP)和氨基末端腦鈉肽前體(N-terminal pro-B-type natriuretic peptide,NT-proBNP)的含量;利用放免法檢測(cè)血漿中血管緊張素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)的含量;利用Haematoxylin-eosin(HE)染色檢測(cè)各組大鼠心肌組織中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及細(xì)胞肥大情況;TUNEL染色檢測(cè)各組大鼠心肌組織中細(xì)胞凋亡情況:天狼星紅染色檢測(cè)膠原沉積情況;綜合以上方法完成保元湯干預(yù)AMI后HF心室重構(gòu)的藥效評(píng)價(jià)。2.保元湯抑制AMI后HF心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究:體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分,利用免疫組織化學(xué)法(Immunohistochemistry,IHC)檢測(cè)心肌組織中Ang ⅡⅡ的含量;利用蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot,WB)檢測(cè)心肌組織中腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system,RAAS)相關(guān)蛋白、CARP及其下游相關(guān)凋亡蛋白P53、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2Associated X Protein,Bax)等的表達(dá);同時(shí)利用透射電鏡觀察線粒體結(jié)構(gòu)。體外實(shí)驗(yàn)部分,采用Ang Ⅱ刺激制備H9C2細(xì)胞凋亡模型,結(jié)合CCK-8和Hoechst 33258法檢測(cè)H9C2心肌細(xì)胞活力以及保元湯干預(yù)各組心肌細(xì)胞的凋亡情況;利用WB法檢測(cè)心肌細(xì)胞中相關(guān)蛋白的表達(dá);結(jié)合Rhodamine 123染色評(píng)價(jià)保元湯對(duì)Ang Ⅱ刺激導(dǎo)致的心肌細(xì)胞線粒體損傷的影響,綜合以上結(jié)果闡釋保元湯抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。3.保元湯抑制AMI后HF心肌細(xì)胞肥大的機(jī)制研究:體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分,利用WB法檢測(cè)心肌組織中AT1、Calpain 1、CARP以及其下游相關(guān)肥大蛋白鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(Calcineurin)、GATA結(jié)合蛋白4(GATA binding protein4,GATA4)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(Extracellular signa regulated kinase 1/2,Erk1/2)的表達(dá);體外實(shí)驗(yàn)部分,采用Ang Ⅱ刺激H9C2心肌細(xì)胞制備細(xì)胞肥大模型,利用羅丹明鬼筆環(huán)肽和DAPI染色法檢測(cè)保元湯干預(yù)各組H9C2心肌細(xì)胞的肥大情況;利用WB法檢測(cè)細(xì)胞中AT1、Calpain1、CARP以及p-GATA4、p-Erk1/2的表達(dá);利用細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞質(zhì)中CARP的表達(dá);綜合以上結(jié)果闡釋保元湯抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的作用機(jī)制。4.為進(jìn)一步驗(yàn)證CARP調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡和肥大的途徑以及保元湯能否通過干預(yù)CARP進(jìn)而調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡與肥大,在體外采用pcDNA3.1-Ankrd1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染制備過表達(dá)CARP細(xì)胞模型,采用Hoechst 33258及羅丹明鬼筆環(huán)肽染色法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡與肥大情況;利用WB法檢測(cè)心肌細(xì)胞中CARP以及相關(guān)凋亡和肥大蛋白的表達(dá);綜合以上結(jié)果闡釋保元湯通過調(diào)控CARP進(jìn)而調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡與肥大的作用機(jī)制。結(jié)果:1.保元湯干預(yù)AMI后HF大鼠心室重構(gòu)的藥效學(xué)研究經(jīng)保元湯治療后,各組大鼠因損傷而下降的射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction,EF)和短軸縮短率(fractional shortening,FS)均得到不同程度地改善(P0.05,P0.01),提示保元湯能有效抑制缺血損傷引發(fā)的大鼠心功能的下降。此外,保元湯治療還能顯著抑制左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular internal dimension diastole,LVIDd)以及左心室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular internal dimension systole,LVIDs)的增加(P0.01),提示保元湯能夠在一定程度上抑制HF大鼠的心室重構(gòu)。心肌酶譜檢測(cè)結(jié)果顯示,保元湯能夠抑制心肌細(xì)胞中CK、LDH(P0.01)的釋放。同時(shí)能有效抑制血漿中HF標(biāo)志物以及Ang Ⅱ(P0.05)的水平,提示保元湯能抑制AMI導(dǎo)致的心肌損傷。HE染色結(jié)果顯示,保元湯能夠顯著抑制心肌組織中的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)以及心肌細(xì)胞肥大(P0.01)。TUNEL染色結(jié)果顯示,保元湯能有效抑制梗死邊緣區(qū)心肌細(xì)胞凋亡。天狼星紅染色結(jié)果顯示,保元湯能夠抑制心肌間質(zhì)膠原的過度沉積。以上結(jié)果提示,保元湯具有抑制AMI后HF大鼠心室重構(gòu)進(jìn)而改善心功能的作用。陽性對(duì)照藥物福辛普利鈉片也顯示出較好的改善心功能、減少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及抑制細(xì)胞凋亡和肥大的作用。2.保元湯調(diào)控AT1-CARP通路抑制AMI后HF心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究IHC檢測(cè)結(jié)果顯示保元湯能夠降低心肌組織中Ang Ⅱ的水平(P0.01);WB結(jié)果顯示保元湯能夠顯著下調(diào)AT1(P0.01)、ACE1(P0.001)以及CARP(P0.01)的表達(dá);同時(shí)抑制CARP下游促凋亡蛋白P53(P0.001)、Bax(P0.001)以及Cleaved caspase-3(P0.001)的表達(dá),上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2(P0.05)與Mdm2(P0.01)的表達(dá)。透射電鏡結(jié)果顯示,保元湯能抑制線粒體結(jié)構(gòu)損傷。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)部分,MTT和Hoechst 33258檢測(cè)結(jié)果表明保元湯能夠抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞凋亡。WB結(jié)果表明保元湯能通過下調(diào)心肌細(xì)胞中AT1、CARP以及P53和Bax的表達(dá)進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡。此外,Rhodamine 123染色結(jié)果顯示,保元湯能夠抑制Ang Ⅱ刺激導(dǎo)致的線粒體膜電位損傷。3.保元湯調(diào)控AT1-CARP通路抑制AMI后HF心肌細(xì)胞肥大的機(jī)制研究WB結(jié)果顯示:保元湯能夠顯著下調(diào)心肌組織中AT1(P0.01)、Calpain1(P0.01)以及CARP(P0.01)的表達(dá),同時(shí)抑制CARP下游調(diào)控的促肥大蛋白GATA4(P0.001)和Erk1/2(P0.01)的磷酸化,對(duì)CARP下游另一肥大蛋白Calcineurin的表達(dá)沒有明顯的調(diào)控作用。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)部分,羅丹明鬼筆環(huán)肽染色結(jié)果顯示保元湯能夠抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞肥大。WB結(jié)果表明保元湯能顯著下調(diào)心肌細(xì)胞中AT1、Calpain 1和CARP的表達(dá),同時(shí)抑制CARP下游肥大蛋白GATA4和Erk1/2的磷酸化。此外,免疫熒光染色結(jié)果表明,保元湯能夠抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的細(xì)胞質(zhì)中CARP的表達(dá)增加。4.保元湯調(diào)控CARP進(jìn)而調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡和肥大的機(jī)制驗(yàn)證Hoechst33258及羅丹明鬼筆環(huán)肽染色結(jié)果分別顯示pcDNA3.1-Ankrd1質(zhì)粒組H9C2心肌細(xì)胞發(fā)生明顯的細(xì)胞凋亡并伴有細(xì)胞表面積的增加;保元湯能夠顯著抑制過表達(dá)CARP引發(fā)的心肌細(xì)胞凋亡,并且能夠有效逆轉(zhuǎn)心肌細(xì)胞的肥大。WB結(jié)果顯示質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組心肌細(xì)胞中CARP的表達(dá)明顯上調(diào),并且能夠促進(jìn)P53的表達(dá)、抑制Mdm2的表達(dá);此外,心肌細(xì)胞中CARP相關(guān)肥大蛋白GATA4和Erk1/2的磷酸化水平也顯著升高。保元湯不僅能夠顯著抑制CARP的過表達(dá),同時(shí)也能夠下調(diào)CARP下游凋亡蛋白P53的表達(dá),并且對(duì)其調(diào)控的肥大相關(guān)蛋白GATA4和Erk1/2的磷酸化也有顯著的抑制作用。結(jié)論:1.藥效研究提示保元湯能有效改善AMI后HF大鼠心功能的急劇下降,同時(shí)能有效抑制心室重構(gòu)引起的左心室內(nèi)徑增加,降低HF大鼠血清中CK和LDH的水平;有效降低循環(huán)中HF標(biāo)志物及Ang Ⅱ的水平。此外,保元湯能夠有效抑制心肌組織中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、心肌細(xì)胞肥大、細(xì)胞凋亡以及膠原的過度沉積。以上藥效結(jié)果共同提示保元湯改善AMI后HF大鼠心功能的作用與其抑制心肌細(xì)胞凋亡和肥大等心室重構(gòu)病理環(huán)節(jié)密切相關(guān),為后續(xù)的機(jī)制研究提供方向。2.保元湯抗心肌細(xì)胞凋亡作用的體內(nèi)與體外機(jī)制研究結(jié)果表明:心肌缺血導(dǎo)致心肌組織中Ang Ⅱ水平升高,進(jìn)一步激活其受體AT1的表達(dá),使得心肌組織中CARP蛋白出現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài);進(jìn)而啟動(dòng)P53-線粒體凋亡途徑,使得心肌細(xì)胞中P53、Bax以及Cleaved caspase-3的表達(dá)升高,Bcl-2、Mdm2的表達(dá)下降。給予保元湯干預(yù)后,能夠有效抑制心肌組織中Ang Ⅱ的水平,進(jìn)一步下調(diào)AT1的表達(dá),進(jìn)而抑制心肌細(xì)胞中CARP的高表達(dá);同時(shí)保元湯能夠促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl-2、Mdm2的表達(dá),并抑制促凋亡蛋白P53、Bax以及Cleaved caspase-3的表達(dá),進(jìn)而發(fā)揮抗心肌細(xì)胞凋亡的作用。同時(shí),利用pcDNA3.1-Ankrd1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染使得CARP在H9C2心肌細(xì)胞中過表達(dá),給予保元湯進(jìn)行干預(yù),結(jié)果顯示保元湯能夠有效抑制心肌細(xì)胞中過表達(dá)的CARP的水平,且對(duì)其下游調(diào)控分子P53亦有相同的抑制作用。綜上,保元湯能通過調(diào)控AT1-CARP通路進(jìn)而抑制AMI后HF大鼠心肌細(xì)胞凋亡;CARP成為保元湯改善心功能、抑制心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白以及潛在靶標(biāo)。3.保元湯抗心肌細(xì)胞肥大作用的體內(nèi)與體外機(jī)制研究結(jié)果表明:AMI術(shù)后28 d,伴隨著心肌組織持續(xù)的心肌缺血,心肌細(xì)胞中AT1-CARP通路激活的同時(shí),CARP下游調(diào)控肥大的GATA4/Erk1/2通路被激活,進(jìn)而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞面積增大、加重HF程度。給予保元湯干預(yù)后,能夠通過調(diào)控AT1-CARP通路,進(jìn)而抑制GATA4/Erk1/2肥大途徑中相關(guān)蛋白的磷酸化,保持心肌細(xì)胞的正常大小與直徑,預(yù)防心室重構(gòu)的發(fā)生并延緩HF惡化的程度。同時(shí),通過在體外對(duì)CARP的過表達(dá)以及保元湯的干預(yù),結(jié)果發(fā)現(xiàn),保元湯在通過AT1調(diào)控CARP的表達(dá)量的同時(shí),能夠抑制CARP的過表達(dá),進(jìn)而抑制促肥大蛋白GATA4的磷酸化,多途徑發(fā)揮抗心肌細(xì)胞肥大的作用。同時(shí),該結(jié)果亦提示CARP為保元湯發(fā)揮抗心肌細(xì)胞肥大作用的關(guān)鍵蛋白與潛在靶標(biāo)。4.本研究通過對(duì)補(bǔ)氣名方保元湯抑制AMI后HF心肌細(xì)胞凋亡及肥大藥效以及通過調(diào)控AT1-CARP通路抗凋亡和肥大作用機(jī)制的闡明,尤其是對(duì)CARP調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡、肥大機(jī)制的驗(yàn)證以及保元湯對(duì)CARP調(diào)控作用的闡明,為以CARP為新的關(guān)鍵蛋白與靶標(biāo)抑制心室重構(gòu)延緩HF進(jìn)程的治療提供新的干預(yù)途徑與治療思路,并為保元湯防治HF的臨床應(yīng)用以及新藥開發(fā)乃至組方的二次優(yōu)化提供有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285.5
【圖文】：

ＣＡＲＰ基因定位在人類基因組中的１０號(hào)染色體上，且ＣＡＲＰ蛋白序列在哺乳動(dòng)物中高逡逑度保守［９］。ＣＡＲＰ的ｃＤＮＡ長(zhǎng)度為１９０１個(gè)堿基對(duì)，編碼由３１９個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，逡逑理論分子量為３６，２５２邋Ｄａ［２］。ＣＡＲＰ蛋白結(jié)構(gòu)由如下特征組成（圖１）：邋（１）卷曲螺旋結(jié)構(gòu)逡逑域（ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌｄｏｍａｉｎ）；邋（２）串聯(lián)錨定重復(fù)序列（ＡＮＫ）；邋（３）核定位特征基序；（４）逡逑ＰＥＳＴ蛋白降解序列；（５）推定的翻譯后修飾位點(diǎn)［１（）］。卷曲螺旋基序通常由２－５個(gè)ａ－螺旋逡逑的超螺旋組成，它們彼此纏繞并且在結(jié)構(gòu)上能夠介導(dǎo)蛋白質(zhì)的低聚化［１１］。此外，Ｗｉｔｔ逡逑等研究表明，盡管蛋白之間相互作用相對(duì)較弱，ＣＡＲＰ的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域仍有助于其自逡逑身二聚化［１２］。逡逑１３逡逑

Ｓｈａｍ邋Ｍｏｄｅｌ邋ＢＹＤ邋Ｆｏｓｉｎｏｐｒｉｌ邐Ｓｈａｍ邋Ｍｏｄｅｌ邋ＢＹＤ邋Ｆｏｓｉｎｏｐｒｉｌ逡逑圖２．２各組大鼠超聲指標(biāo)分析逡逑注：與模型組比較，＞＜０．０５，＊＞＜０．０１；與假手術(shù)組比較，＿Ｐ＜０．００１逡逑２．保元湯對(duì)心梗后心衰大鼠心肌酶的影響逡逑為了更好的評(píng)判心梗后心肌損傷程度，本研究對(duì)血清中相關(guān)損傷標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)。逡逑３８逡逑

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