【摘要】：水蛭為螞蟥Whitmania pigra Whitman、水蛭Hirudo nipponica Whitman和柳葉螞蟥Whitmania acranulata Whitman的干燥全體,具有破血通經(jīng),逐瘀消瘢之功效。在中藥材市場上,水蛭的主要來源為螞蟥(又稱寬體金線蛭),另有少量的水蛭(又稱日本醫(yī)蛭),而柳葉螞蟥(又稱尖細(xì)金線蛭)較為罕見。隨著近年來含水蛭中成藥的不斷開發(fā),水蛭的需求量增加,已成為了緊俏中藥材之一,市面上出現(xiàn)了以偽品菲牛蛭代替水蛭入藥的情況。研究表明,偽品菲牛蛭和螞蟥在發(fā)揮抗凝血活性時(shí)對凝血酶的作用機(jī)制以及抗凝血途徑有一定區(qū)別,在臨床上混用對患者用藥安全與有效帶來不良影響。傳統(tǒng)的鑒定方法以水蛭的性狀特征為依據(jù),但在藥材市場上,水蛭商品主要有清水吊干品、水蛭段和燙水蛭,在外形特征上與基原動(dòng)物相比變化較大,很難準(zhǔn)確鑒定;此外,螞蟥作為中藥水蛭的主要品種,其發(fā)揮抗凝血活性的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制仍不明確。本論文研究依據(jù)正品水蛭及其常見偽品菲牛蛭的COI序列差異設(shè)計(jì)了物種特異性引物,并通過PCR建立水蛭的DNA分子鑒定技術(shù),用于鑒定中藥水蛭的真?zhèn)?摻偽);利用SDS-PAGE和2-DE分別對正品水蛭及其偽品基原動(dòng)物的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)不同品種水蛭的電泳圖譜中,存在穩(wěn)定出現(xiàn)的蛋白質(zhì)條帶及斑點(diǎn),可作為中藥水蛭真?zhèn)舞b定的依據(jù);選取不同品種水蛭的SDS-PAGE蛋白條帶,對其膠內(nèi)消化后所得的多肽片段混合物以MALDI-TOF-MS進(jìn)行分析,鑒定所含有的蛋白質(zhì);此外,對螞蟥中抗凝血活性蛋白質(zhì)進(jìn)行提取,以血漿復(fù)鈣時(shí)間為活性指標(biāo),通過DEAE-52、Sephadex G-75和Sephadex LH-20對抗凝血蛋白質(zhì)進(jìn)行分離,并利用MALDI-TOF-MS進(jìn)行鑒定。主要研究內(nèi)容如下:(1)首先基于寬體金線蛭、尖細(xì)金線蛭、日本醫(yī)蛭和菲牛蛭的COI序列基因差異設(shè)計(jì)篩選出3對特異性引物,提取不同品種水蛭的DNA,并對退火溫度進(jìn)行優(yōu)化,確定最適的PCR擴(kuò)增程序;然后對引物的特異性、靈敏度和適用性進(jìn)行考察,最后將所建立的特異性引物擴(kuò)增技術(shù)應(yīng)用于市售水蛭商品的檢測。結(jié)果表明,設(shè)計(jì)篩選得到的3對引物專屬性強(qiáng),其中寬體金線蛭和尖細(xì)金線蛭共用一對引物,目的產(chǎn)物長度為63 bp;日本醫(yī)蛭和菲牛蛭的目的擴(kuò)增產(chǎn)物長度分別為102 bp和75 bp。3對引物的特異性良好,彼此之間無交叉反應(yīng),且具有較高的靈敏度,同時(shí)還能用于鑒別摻偽品。此外,對水蛭市售商品的檢測結(jié)果顯示,19批次水

本文編號：2736398