發(fā)布時間：2020-07-01 06:17

【摘要】：目的:研究淫羊藿苷(Icariin,ICA)對6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元損傷的保護作用,并探討其機制是否與調(diào)節(jié)Nrf2信號通路有關(guān)。方法:1、動物實驗:采用雄性野生型和Nrf2基因敲除型小鼠,隨機分為空白組,ICA(60 mg/kg)組,6-OHDA(4μg)組和6-OHDA+ICA組。采用單側(cè)注射6-OHDA于中腦黑質(zhì)(substantia nigra,SN)中制備多巴胺(dopamine,DA)能神經(jīng)元損傷的模型,小鼠于造模前3天開始灌胃ICA,造模后連續(xù)灌胃7天,每天一次。通過轉(zhuǎn)棒實驗和曠場實驗觀察小鼠的運動能力;冰凍切片免疫熒光和Western blotting分析DA能神經(jīng)元特異性標(biāo)記物-酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)、小膠質(zhì)細胞特異性標(biāo)記物-離子鈣結(jié)合蛋白-1(ionized calcium-binding adapter molecule-1,Iba-1)和星形膠質(zhì)細胞特異性標(biāo)記物-膠質(zhì)細胞原纖維酸性蛋白(glia fibrillary acidic protein,GFAP)的表達;UHPLC檢測小鼠紋狀體內(nèi)DA及其代謝物的含量;real-time RT-PCR和Western blotting觀察中腦核因子E2相關(guān)因子2(Nuclear factor erythroid-2 related factor2,Nrf2)、Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)、血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)及NADPH醌氧化還原酶1(NADPH quinone oxidoreductase 1,NQO1)的表達;Western blotting檢測中腦炎性細胞因子,如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)的表達;Western blotting檢測神經(jīng)營養(yǎng)因子,如膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glia cells line-derived neurotrophic factor,GDNF)和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)的表達。2、細胞實驗:采用原代神經(jīng)元-膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)和原代神經(jīng)元培養(yǎng)體系,細胞隨機分為空白組,ICA(0.1μM)組,6-OHDA(40μM)組和6-OHDA+ICA組。細胞用ICA預(yù)處理30 min后加入6-OHDA。7天后用Western blotting檢測兩種培養(yǎng)體系中TH蛋白的表達。為進一步研究膠質(zhì)細胞中的Nrf2是否參與ICA介導(dǎo)的DA神經(jīng)保護,原代膠質(zhì)細胞接種于Transwells,加入Nrf2 siRNA處理24 h后,將Transwells轉(zhuǎn)入種有原代神經(jīng)元的培養(yǎng)板中,重組的神經(jīng)元-膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)分組為:空白組,control-siRNA(40 nmol/L)組,Nrf2-siRNA(40 nmol/L)組,ICA(0.1μM)組,6-OHDA(40μM)組,6-OHDA+ICA組和6-OHDA+ICA+Nrf2-siRNA組。細胞用ICA預(yù)處理30 min后加入6-OHDA。7天后用免疫熒光和Western blotting檢測DA能神經(jīng)元的表達。結(jié)果:1、動物實驗:在野生型小鼠中,與空白組相比,6-OHDA組DA能神經(jīng)元數(shù)量明顯減少,DA及其代謝物的含量減少,小鼠行為能力下降,伴有小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞的激活,TNF-α和iNOS的蛋白水平增高,同時Nrf2信號通路的基因和蛋白水平增加;與6-OHDA組相比,ICA處理后,DA能神經(jīng)元數(shù)量增加,DA及其代謝物的含量增加,膠質(zhì)細胞的激活和炎性細胞因子的釋放減少,進一步上調(diào)Nrf2信號通路的基因和蛋白水平。但是在Nrf2基因敲除型小鼠中,ICA的神經(jīng)保護作用消失,ICA不能抑制膠質(zhì)細胞的激活和炎性細胞因子的釋放,并且ICA對Nrf2信號通路基因和蛋白的表達沒有明顯變化。2、細胞實驗:在原代神經(jīng)元培養(yǎng)和原代神經(jīng)元-膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)中,6-OHDA組TH的表達減少,ICA處理后,只有神經(jīng)元-膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)中TH的表達增加,而神經(jīng)元培養(yǎng)(沒有膠質(zhì)細胞)中則沒有神經(jīng)保護作用。通過Nrf2-siRNA沉默膠質(zhì)細胞中的Nrf2,應(yīng)用Transwells構(gòu)建重組的神經(jīng)元-膠質(zhì)細胞共培養(yǎng),在該體系中,ICA對DA能神經(jīng)元無保護作用。結(jié)論:ICA通過調(diào)節(jié)膠質(zhì)細胞中的Nrf2抑制神經(jīng)炎癥并保護6-OHDA誘導(dǎo)的DA能神經(jīng)元損傷。
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5;R-332
【圖文】：

.1 ICA 對 6-OHDA 誘導(dǎo)的 DA 能神經(jīng)元損傷的保護作用在野生型小鼠中，我們研究了 ICA對 6-OHDA誘導(dǎo)的DA 神經(jīng)毒性的保護作用先，通過轉(zhuǎn)棒實驗和曠場實驗檢測小鼠的行為能力變化。如圖 1A 和 B 所示，與組相比，6-OHDA 減少了小鼠的轉(zhuǎn)棒時間和運動距離，ICA(60 mg/kg)處理后，時間和運動距離較 6-OHDA 組有所增加，單獨給予 ICA(60mg/kg)后相對于空白鼠的運動能力無明顯變化。免疫熒光結(jié)果顯示，與空白組比較，單獨給予 ICAg/kg)對中腦內(nèi) DA 能神經(jīng)元無顯著影響，而 6-OHDA 組的 DA 能神經(jīng)元數(shù)量明少，ICA(60mg/kg)治療后，DA 能神經(jīng)元損傷得到改善(圖 2A 和 B)。中腦 DA經(jīng)元的蛋白定量與免疫熒光結(jié)果一致(圖 2C)。如圖 3A 和 B 所示，與空白組比較OHDA 降低小鼠紋狀體內(nèi) DA 和 DOPAC 的含量，對 HVA 的含量沒有顯著影響 6-OHDA 組比較，ICA(60mg/kg)處理后 DA 的含量有所升高，而 HVA 和 DO含量無明顯改變。此外，6-OHDA 組 DA 代謝物的比率增加，而 6-OHDA+ICA謝物比率降低。

2 ICA 對 6-OHDA 誘導(dǎo)的 DA 能神經(jīng)元損傷的保護作用 A. TH 免疫熒光染色；B. TH 陽性計數(shù)（標(biāo)尺=200μm）；C.TH 蛋白的表達。（ x ±SEM，n=5） *P<0.05 與空白組比較；#P<0. 6-OHDA 組比較。ig.2ICAprotectedDAneuronsagainst6-OHDA-inducedneurotoxicityA.TH immunofluorescentaining; B.TH positive cell counting (Scale bar=200 μm); C. TH protein expression. ( ±SEM, n=P<0.05 vs control group,#P<0.05 vs 6-OHDAgroup.

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本文編號：2736387