發(fā)布時間：2020-07-01 04:20

【摘要】：目的:慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)是指各種原因導致的腎臟損傷和(或)腎小球濾過率(glomerularfiltrationrate,GFR)下降,包括各類腎小球疾病、腎小管間質疾病以及腎血管疾病。CKD已成為世界性的公共健康問題,因此,開展對CKD治療以及治療機制的研究具有重要的醫(yī)學價值和社會意義。足細胞的足突及足突間的裂孔隔膜是腎小球濾過屏障的重要組成部分,足細胞能夠產(chǎn)生腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system,RAS)的組分并且表達RAS相關受體,包括血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AngⅡ)、鹽皮質激素及其蛋白受體等,足細胞的收縮、凋亡、自噬以及細胞骨架的形成都受到AngⅡ1型受體的調控。活性氧簇(reactive oxide species,ROS)參與自噬的啟動及結局過程,自噬能夠清除損傷的線粒體以及氧化蛋白,是對ROS造成細胞損傷的重要保護機制,能夠緩解細胞損傷。AngⅡ能夠提高ROS的表達,通過氧化應激誘導足細胞自噬,抑制氧化應激作用的藥物能夠抑制自噬水平。前期研究結果顯示,加味黃芪赤風湯能夠抑制阿霉素誘導的足細胞過度自噬,同時改善阿霉素腎病大鼠腎臟氧化應激損傷,鑒于RAS在腎臟病變中的重要作用,我們建立AngⅡ刺激足細胞損傷模型,探討加味黃芪赤風湯基于ROS-自噬通路對Ang Ⅱ誘導腎小球足細胞損傷的保護機制。方法:制備加味黃芪赤風湯以及替米沙坦含藥血清,CCK-8法檢測含藥血清對足細胞的毒性作用。AngⅡ分別選用濃度10-8mol/L至10-4mol/L,作用于足細胞24h,采用CCK-8法檢測足細胞活性;選用10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L三個AngⅡ濃度,作用于足細胞24h,應用western blot檢測足細胞損傷相關蛋白nephrin、podocin的表達,建立AngⅡ足細胞損傷模型。通過western blot檢測足細胞損傷相關蛋白nephrin、podocin的表達以及檢測自噬相關蛋白LC3、Beclin-1與p62的表達,溶酶體熒光探針檢測自噬流活性,透射電鏡觀察足細胞內自噬體的形成,流式細胞儀檢測細胞內活性氧簇ROS的表達,探討加味黃芪赤風湯通過調控ROS-自噬通路對足細胞的保護作用。結果:1.應用CCK-8法檢測足細胞活性,結果顯示,加味黃芪赤風湯及替米沙坦含藥血清組OD值較空白組略有下降,但各組間OD值比較均無統(tǒng)計學差異(P0.05)。結果表明,加味黃芪赤風湯及替米沙坦含藥血清對足細胞無毒性作用。2.建立AngⅡ足細胞損傷模型:應用CCK-8法檢測AngⅡ對足細胞活力的影響,結果顯示,AngⅡ分別選用濃度10-8mol/L至10-4mol/L,干預足細胞24h后,足細胞活力與空白組相比略有下降,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。應用western blot檢測不同濃度AngⅡ對足細胞損傷相關蛋白nephrin、podocin表達的影響,結果顯示,10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/LAngⅡ 均可導致足細胞 nephrin、podocin表達的下降,10-8mol/LAngⅡ組與空白組無明顯差異(P0.05);10-7mol/L、10-6mol/LAngⅡ組與空白組相比,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。參考文獻,AngⅡ濃度在10-6mol/L時,對自噬現(xiàn)象的誘導并不強于10-7mol/L、10-8mol/L,且10-8mol/L AngⅡ不能造成足細胞明顯的損傷,結合本實驗的目的為探討加味黃芪赤風湯對AngⅡ誘導足細胞損傷及自噬流的作用,因此,最終選用AngⅡ濃度為10-7mol/L造模。3.AngⅡ能夠導致足細胞nephrin、podocin表達的下調,與空白組相比,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01);加味黃芪赤風湯及替米沙坦能夠上調nephrin、podocin的表達,加味黃芪赤風湯低劑量組與模型組相比,組間差異無統(tǒng)計學差異(P0.05);加味黃芪赤風湯中劑量、高劑量及替米沙坦組能顯著提高nephrin、podocin的表達,與模型組相比,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。4.3MA及氯喹可導致足細胞活性降低,與模型組相比,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);并且,3MA及氯喹可降低足細胞nephrin、podocin的表達,與模型組之間的差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。5.應用western blot檢測足細胞自噬相關蛋白LC3、Beclin-1、p62的表達,結果表明,AngⅡ可上調自噬相關蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1的表達,下調p62的表達,與空白組相比,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01);加味黃芪赤風湯及替米沙坦則能下調自噬相關蛋白LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ、Beclin-1的表達,上調p62的表達,與模型組相比(P0.05)。6.透射電鏡結果顯示:空白組足細胞結構完好,核膜、核仁清晰,細胞器結構正常,存在少量雙層膜結構的自噬體。模型組可見雙層膜結構的自噬體數(shù)量增多,體積增大,自噬體內可包裹有細胞器;加味黃芪赤風湯及替米沙坦含藥血清干預后,可見足細胞內自噬體數(shù)量減少,并且隨加味黃芪赤風湯含藥血清濃度增加而減少。結果表明,AngⅡ能夠誘導足細胞自噬,加味黃芪赤風湯及替米沙坦能夠抑制足細胞自噬,與western blot結果相一致。7.自噬過程中,自噬體需與溶酶體結合才能完成底物的降解,溶酶體與自噬體結合,由初級溶酶體轉化為次級溶酶體,酸度升高,從而具有降解內容物的功能,溶酶體熒光探針能夠標記酸性溶酶體,反映溶酶體的功能。含藥血清干預足細胞后,熒光顯微鏡下觀察溶酶體變化。結果顯示,模型組溶酶體功能表達增強,加味黃芪赤風湯及替米沙坦干預后溶酶體表達減弱。結果表明,AngⅡ不僅能夠誘導足細胞自噬的啟動,而且能夠促進自噬體與溶酶體的結合,上調整個自噬流的水平;相反,加味黃芪赤風湯及替米沙坦則抑制整個自噬流的水平。8.流式細胞儀檢測足細胞內ROS的表達,與空白組相比,模型組ROS表達增多(P0.01);與模型組相比,加味黃芪赤風湯各劑量組以及替米沙坦組ROS表達減少(P0.05)。結果表明,AngⅡ誘導足細胞ROS的表達,加味黃芪赤風湯下調ROS的表達。結論:1.AngⅡ通過下調足細胞nephrin、podocin的表達,損傷足細胞。2.加味黃芪赤風湯可上調Ang Ⅱ誘導的nephrin、podocin的表達,緩解足細胞損傷。3.Ang Ⅱ誘導的自噬具有保護足細胞的作用,抑制自噬則導致足細胞活性降低。4.加味黃芪赤風湯可能是基于ROS-自噬通路,下調AngⅡ誘導的自噬流,拮抗腎小球足細胞損傷。
【學位授予單位】：中國中醫(yī)科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285
【圖文】：

按２．３分組，含藥血清干預足細胞２４ｈ后，應用ＣＣＫ－８法檢測足細胞活性。逡逑結果顯示，加味黃芪赤風湯及替米沙坦含藥血清組ＯＤ值較空白組略有下降，但逡逑各組間ＯＤ值比較均無統(tǒng)計學差異（Ｐ＞０．０５），見表１，圖１。結果表明，加味逡逑黃芪赤風湯及替米沙坦含藥血清對足細胞無毒性作用。逡逑表１加味黃芪赤風湯含藥血清對足細胞的毒性作用（ｆ邋±＾）逡逑組別邐空白組邐低劑量組邐中劑量組邐高劑量組邐替米沙坦組逡逑ＯＤ邋值邐０．８６士０．０２邐０．８６±０．０２邐０．８５±０．０２邐０．８４±０．０２邐０．８５士０．０３逡逑Ｉ＂逡逑＿＿，＿，＿逡逑圖１加味黃芪赤風湯含藥血清對足細胞的毒性作用逡逑注：Ｎｏｒｍａｌ：空白組；ＪＷＨＱＣＦＴ－Ｌ：加味黃芪赤風湯低劑量組；ＪＷＨＱＣＦＴ－Ｍ：加味黃芪赤風湯中劑量逡逑組；■ＦＷＨＱＣＦＴ－Ｈ：加味黃芪赤風湯高劑量組；＿Ｔｅｌｍｉｓａｒｔａｎ：替米沙坦組？逡逑３３逡逑

１０＿６ｍｏｌ／Ｌ、３ｘｌ0－６ｍ0ｌ／Ｌ、１０—５ｍｏｌ／Ｌ、３ｘｌ（Ｔ５ｍｏｌ／Ｌ、ｌＣｒｔｎｏｌ／Ｌ，應用邋ＣＣＫ－８邋法檢逡逑測Ａｎｇ邋ＩＩ對足細胞活力的影響。結果顯示，各濃度Ａｎｇ邋ＩＩ干預足細胞２４ｈ后，足逡逑細胞活力與空白組相比略有下降，差異無統(tǒng)計學意義（Ｐ＞0．0５），見表２，圖２。逡逑應用以６５１６１１１１３１0１檢測不同濃度八＾１１對足細胞損傷相關蛋白１＾１１１＇丨１１４0＜１0（＾１１表逡逑達的影響，結果顯示，ｌ0＿８ｍｏｌ／Ｌ、１０＿７ｍｏｌ／Ｌ、１０－６ｍｏｌ／ＬＡｎｇＩＩ均可導致足細胞逡逑ｎｅｐｈｒｉｎ、ｐｏｄｏｃｉｎ表達的下降，１０＿８ｍｏｌ／Ｌ邋Ａｎｇ邋ＩＩ組與空白組相比無明顯差異逡逑（辦０．０５）邋；邋１０＿７ｍｏｌ／Ｌ、ｌ0－６ｍｏｌ／ＬＡｎｇＩＩ組與空白組相比，差異具有統(tǒng)計學意義逡逑（尸＜０．０５），見圖３。參考文獻，Ａｎｇｌｌ濃度在１０＿６ｍｏｌ／Ｌ時，對自噬現(xiàn)象的誘導逡逑并不強于ｌ0－７ｍｏｌ／Ｌ、１０＿８ｍｏｌ／Ｌ［１６，１７］，且１０＿８ｍｏｌ／ＬＡｎｇＩＩ不能造成足細胞明顯的逡逑損傷，結合本實驗的目的為探討加味黃芪赤風湯對Ａｎｇ邋ＩＩ誘導足細胞損傷及自噬逡逑流的作用

【參考文獻】

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本文編號：2736266