【摘要】：目的:慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)是指各種原因?qū)е碌哪I臟損傷和(或)腎小球?yàn)V過率(glomerularfiltrationrate,GFR)下降,包括各類腎小球疾病、腎小管間質(zhì)疾病以及腎血管疾病。CKD已成為世界性的公共健康問題,因此,開展對CKD治療以及治療機(jī)制的研究具有重要的醫(yī)學(xué)價(jià)值和社會意義。足細(xì)胞的足突及足突間的裂孔隔膜是腎小球?yàn)V過屏障的重要組成部分,足細(xì)胞能夠產(chǎn)生腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system,RAS)的組分并且表達(dá)RAS相關(guān)受體,包括血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AngⅡ)、鹽皮質(zhì)激素及其蛋白受體等,足細(xì)胞的收縮、凋亡、自噬以及細(xì)胞骨架的形成都受到AngⅡ1型受體的調(diào)控�；钚匝醮�(reactive oxide species,ROS)參與自噬的啟動及結(jié)局過程,自噬能夠清除損傷的線粒體以及氧化蛋白,是對ROS造成細(xì)胞損傷的重要保護(hù)機(jī)制,能夠緩解細(xì)胞損傷。AngⅡ能夠提高ROS的表達(dá),通過氧化應(yīng)激誘導(dǎo)足細(xì)胞自噬,抑制氧化應(yīng)激作用的藥物能夠抑制自噬水平。前期研究結(jié)果顯示,加味黃芪赤風(fēng)湯能夠抑制阿霉素誘導(dǎo)的足細(xì)胞過度自噬,同時改善阿霉素腎病大鼠腎臟氧化應(yīng)激損傷,鑒于RAS在腎臟病變中的重要作用,我們建立AngⅡ刺激足細(xì)胞損傷模型,探討加味黃芪赤風(fēng)湯基于ROS-自噬通路對Ang Ⅱ誘導(dǎo)腎小球足細(xì)胞損傷的保護(hù)機(jī)制。方法:制備加味黃芪赤風(fēng)湯以及替米沙坦含藥血清,CCK-8法檢測含藥血清對足細(xì)胞的毒性作用。AngⅡ分別選用濃度10-8mol/L至10-4mol/L,作用于足細(xì)胞24h,采用CCK-8法檢測足細(xì)胞活性;選用10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L三個AngⅡ濃度,作用于足細(xì)胞24h,應(yīng)用western blot檢測足細(xì)胞損傷相關(guān)蛋白nephrin、podocin的表達(dá),建立AngⅡ足細(xì)胞損傷模型。通過western blot檢測足細(xì)胞損傷相關(guān)蛋白nephrin、podocin的表達(dá)以及檢測自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin-1與p62的表達(dá),溶酶體熒光探針檢測自噬流活性,透射電鏡觀察足細(xì)胞內(nèi)自噬體的形成,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧簇ROS的表達(dá),探討加味黃芪赤風(fēng)湯通過調(diào)控ROS-自噬通路對足細(xì)胞的保護(hù)作用。結(jié)果:1.應(yīng)用CCK-8法檢測足細(xì)胞活性,結(jié)果顯示,加味黃芪赤風(fēng)湯及替米沙坦含藥血清組OD值較空白組略有下降,但各組間OD值比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。結(jié)果表明,加味黃芪赤風(fēng)湯及替米沙坦含藥血清對足細(xì)胞無毒性作用。2.建立AngⅡ足細(xì)胞損傷模型:應(yīng)用CCK-8法檢測AngⅡ?qū)ψ慵?xì)胞活力的影響,結(jié)果顯示,AngⅡ分別選用濃度10-8mol/L至10-4mol/L,干預(yù)足細(xì)胞24h后,足細(xì)胞活力與空白組相比略有下降,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。應(yīng)用western blot檢測不同濃度AngⅡ?qū)ψ慵?xì)胞損傷相關(guān)蛋白nephrin、podocin表達(dá)的影響,結(jié)果顯示,10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/LAngⅡ 均可導(dǎo)致足細(xì)胞 nephrin、podocin表達(dá)的下降,10-8mol/LAngⅡ組與空白組無明顯差異(P0.05);10-7mol/L、10-6mol/LAngⅡ組與空白組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。參考文獻(xiàn),AngⅡ濃度在10-6mol/L時,對自噬現(xiàn)象的誘導(dǎo)并不強(qiáng)于10-7mol/L、10-8mol/L,且10-8mol/L AngⅡ不能造成足細(xì)胞明顯的損傷,結(jié)合本實(shí)驗(yàn)的目的為探討加味黃芪赤風(fēng)湯對AngⅡ誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷及自噬流的作用,因此,最終選用AngⅡ濃度為10-7mol/L造模。3.AngⅡ能夠?qū)е伦慵?xì)胞nephrin、podocin表達(dá)的下調(diào),與空白組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);加味黃芪赤風(fēng)湯及替米沙坦能夠上調(diào)nephrin、podocin的表達(dá),加味黃芪赤風(fēng)湯低劑量組與模型組相比,組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);加味黃芪赤風(fēng)湯中劑量、高劑量及替米沙坦組能顯著提高nephrin、podocin的表達(dá),與模型組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。4.3MA及氯喹可導(dǎo)致足細(xì)胞活性降低,與模型組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);并且,3MA及氯喹可降低足細(xì)胞nephrin、podocin的表達(dá),與模型組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5.應(yīng)用western blot檢測足細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin-1、p62的表達(dá),結(jié)果表明,AngⅡ可上調(diào)自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1的表達(dá),下調(diào)p62的表達(dá),與空白組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);加味黃芪赤風(fēng)湯及替米沙坦則能下調(diào)自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ、Beclin-1的表達(dá),上調(diào)p62的表達(dá),與模型組相比(P0.05)。6.透射電鏡結(jié)果顯示:空白組足細(xì)胞結(jié)構(gòu)完好,核膜、核仁清晰,細(xì)胞器結(jié)構(gòu)正常,存在少量雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體。模型組可見雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體數(shù)量增多,體積增大,自噬體內(nèi)可包裹有細(xì)胞器;加味黃芪赤風(fēng)湯及替米沙坦含藥血清干預(yù)后,可見足細(xì)胞內(nèi)自噬體數(shù)量減少,并且隨加味黃芪赤風(fēng)湯含藥血清濃度增加而減少。結(jié)果表明,AngⅡ能夠誘導(dǎo)足細(xì)胞自噬,加味黃芪赤風(fēng)湯及替米沙坦能夠抑制足細(xì)胞自噬,與western blot結(jié)果相一致。7.自噬過程中,自噬體需與溶酶體結(jié)合才能完成底物的降解,溶酶體與自噬體結(jié)合,由初級溶酶體轉(zhuǎn)化為次級溶酶體,酸度升高,從而具有降解內(nèi)容物的功能,溶酶體熒光探針能夠標(biāo)記酸性溶酶體,反映溶酶體的功能。含藥血清干預(yù)足細(xì)胞后,熒光顯微鏡下觀察溶酶體變化。結(jié)果顯示,模型組溶酶體功能表達(dá)增強(qiáng),加味黃芪赤風(fēng)湯及替米沙坦干預(yù)后溶酶體表達(dá)減弱。結(jié)果表明,AngⅡ不僅能夠誘導(dǎo)足細(xì)胞自噬的啟動,而且能夠促進(jìn)自噬體與溶酶體的結(jié)合,上調(diào)整個自噬流的水平;相反,加味黃芪赤風(fēng)湯及替米沙坦則抑制整個自噬流的水平。8.流式細(xì)胞儀檢測足細(xì)胞內(nèi)ROS的表達(dá),與空白組相比,模型組ROS表達(dá)增多(P0.01);與模型組相比,加味黃芪赤風(fēng)湯各劑量組以及替米沙坦組ROS表達(dá)減少(P0.05)。結(jié)果表明,AngⅡ誘導(dǎo)足細(xì)胞ROS的表達(dá),加味黃芪赤風(fēng)湯下調(diào)ROS的表達(dá)。結(jié)論:1.AngⅡ通過下調(diào)足細(xì)胞nephrin、podocin的表達(dá),損傷足細(xì)胞。2.加味黃芪赤風(fēng)湯可上調(diào)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的nephrin、podocin的表達(dá),緩解足細(xì)胞損傷。3.Ang Ⅱ誘導(dǎo)的自噬具有保護(hù)足細(xì)胞的作用,抑制自噬則導(dǎo)致足細(xì)胞活性降低。4.加味黃芪赤風(fēng)湯可能是基于ROS-自噬通路,下調(diào)AngⅡ誘導(dǎo)的自噬流,拮抗腎小球足細(xì)胞損傷。
【學(xué)位授予單位】：中國中醫(yī)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285
【圖文】：

按２．３分組，含藥血清干預(yù)足細(xì)胞２４ｈ后，應(yīng)用ＣＣＫ－８法檢測足細(xì)胞活性。逡逑結(jié)果顯示，加味黃芪赤風(fēng)湯及替米沙坦含藥血清組ＯＤ值較空白組略有下降，但逡逑各組間ＯＤ值比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Ｐ＞０．０５），見表１，圖１。結(jié)果表明，加味逡逑黃芪赤風(fēng)湯及替米沙坦含藥血清對足細(xì)胞無毒性作用。逡逑表１加味黃芪赤風(fēng)湯含藥血清對足細(xì)胞的毒性作用（ｆ邋±＾）逡逑組別邐空白組邐低劑量組邐中劑量組邐高劑量組邐替米沙坦組逡逑ＯＤ邋值邐０．８６士０．０２邐０．８６±０．０２邐０．８５±０．０２邐０．８４±０．０２邐０．８５士０．０３逡逑Ｉ＂逡逑＿＿，＿，＿逡逑圖１加味黃芪赤風(fēng)湯含藥血清對足細(xì)胞的毒性作用逡逑注：Ｎｏｒｍａｌ：空白組；ＪＷＨＱＣＦＴ－Ｌ：加味黃芪赤風(fēng)湯低劑量組；ＪＷＨＱＣＦＴ－Ｍ：加味黃芪赤風(fēng)湯中劑量逡逑組；■ＦＷＨＱＣＦＴ－Ｈ：加味黃芪赤風(fēng)湯高劑量組；＿Ｔｅｌｍｉｓａｒｔａｎ：替米沙坦組？逡逑３３逡逑

１０＿６ｍｏｌ／Ｌ、３ｘｌ0－６ｍ0ｌ／Ｌ、１０—５ｍｏｌ／Ｌ、３ｘｌ（Ｔ５ｍｏｌ／Ｌ、ｌＣｒｔｎｏｌ／Ｌ，應(yīng)用邋ＣＣＫ－８邋法檢逡逑測Ａｎｇ邋ＩＩ對足細(xì)胞活力的影響。結(jié)果顯示，各濃度Ａｎｇ邋ＩＩ干預(yù)足細(xì)胞２４ｈ后，足逡逑細(xì)胞活力與空白組相比略有下降，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｐ＞0．0５），見表２，圖２。逡逑應(yīng)用以６５１６１１１１３１0１檢測不同濃度八＾１１對足細(xì)胞損傷相關(guān)蛋白１＾１１１＇丨１１４0＜１0（＾１１表逡逑達(dá)的影響，結(jié)果顯示，ｌ0＿８ｍｏｌ／Ｌ、１０＿７ｍｏｌ／Ｌ、１０－６ｍｏｌ／ＬＡｎｇＩＩ均可導(dǎo)致足細(xì)胞逡逑ｎｅｐｈｒｉｎ、ｐｏｄｏｃｉｎ表達(dá)的下降，１０＿８ｍｏｌ／Ｌ邋Ａｎｇ邋ＩＩ組與空白組相比無明顯差異逡逑（辦０．０５）邋；邋１０＿７ｍｏｌ／Ｌ、ｌ0－６ｍｏｌ／ＬＡｎｇＩＩ組與空白組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義逡逑（尸＜０．０５），見圖３。參考文獻(xiàn)，Ａｎｇｌｌ濃度在１０＿６ｍｏｌ／Ｌ時，對自噬現(xiàn)象的誘導(dǎo)逡逑并不強(qiáng)于ｌ0－７ｍｏｌ／Ｌ、１０＿８ｍｏｌ／Ｌ［１６，１７］，且１０＿８ｍｏｌ／ＬＡｎｇＩＩ不能造成足細(xì)胞明顯的逡逑損傷，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)的目的為探討加味黃芪赤風(fēng)湯對Ａｎｇ邋ＩＩ誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷及自噬逡逑流的作用

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2736266