發(fā)布時間：2020-07-01 03:00

【摘要】：肺纖維化(Pulmonary fibrosis,PF)是一種由多種因素引起的以彌漫性肺泡炎和肺泡結(jié)構(gòu)紊亂最終導致肺間質(zhì)纖維化為特征的疾病。該病的主要病理特點是早期以下呼吸道急性炎癥反應(yīng)為主,并伴隨著大量成纖維細胞病理性增生轉(zhuǎn)型,導致后期某些細胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)成分在肺泡和間質(zhì)內(nèi)沉積,纖維組織過度修復造成肺組織結(jié)構(gòu)的紊亂、肺泡損傷、膠原沉積,最終導致肺纖維化。隨著工業(yè)化的發(fā)展,肺纖維化發(fā)病率呈逐年上升趨勢,因其缺乏有效的治療手段,預后差、死亡率高,嚴重危害人類健康與生命。肺纖維化的發(fā)病機制欠清晰,其中炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)和膠原沉積是對肺纖維化發(fā)病機理的重要詮釋。目前臨床上以糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑治療為主,但只能在一定程度上緩解某些癥狀,不能從根本上逆轉(zhuǎn)和治療,也不能防御肺纖維化,并有不同程度的毒副作用。對于肺纖維化,中醫(yī)藥以其豐富的臨床用藥經(jīng)驗以及多成分、多靶點、多通路治療手段為特點,近年來受到了國內(nèi)外學者的重視。復方芒果葉(Compound mango leaves,CML)干膏系廣西終身教授、名中醫(yī)鄧家剛主任醫(yī)師根據(jù)多年臨床經(jīng)驗擬定的治療肺纖疾患的復方。本研究以復方芒果葉干膏為研究對象,采用博萊霉素(Bleomycin,BLM)介導的肺纖維化動物模型對其相關(guān)病理學、細胞因子、差異蛋白等進行藥效與機制的探討,并利用細胞炎癥模型篩選復方芒果葉干膏有效抗炎物質(zhì)及研究復方對肺纖維化相關(guān)的炎癥通路的作用。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:1、復方芒果葉干膏抗肺纖維化藥效研究:運用BLM氣管注射法建立小鼠肺纖維化模型,觀察小鼠的整體情況、病理表現(xiàn)以及檢測肺組織中羥脯氨酸(Hydroxyproline,HYP)、相關(guān)細胞炎癥因子、相關(guān)抗氧化應(yīng)激因子的表達水平,從體內(nèi)水平上對復方芒果葉干膏抗炎、抗氧化以及抗纖維化藥效進行評價。結(jié)果顯示,復方芒果葉干膏高劑量組小鼠呼吸逐漸平穩(wěn)、活潑好動、毛色整齊有光澤、進食正常、體重逐漸上升,中、低劑量組均有好轉(zhuǎn)。另外,復方芒果葉干膏高、中、低劑量組小鼠肺組織的肺指數(shù)均顯著性降低(P0.001)。以上提示:復方芒果葉干膏從整體水平上對肺纖維化小鼠的狀態(tài)和肺組織具有保護作用。病理觀察發(fā)現(xiàn),蘇木精-伊紅染色法(Hematoxylin-eosin staining,HE)觀察模型組肺組織結(jié)構(gòu)破壞嚴重,損傷分布較廣,部分支氣管腔和肺泡腔內(nèi)可見大量炎性滲出物,中度至重度肺泡炎伴纖維組織增生及纖維化致肺實變,給藥組肺組織結(jié)構(gòu)清晰、形態(tài)正常,肺泡炎和肺纖維化明顯減少,未見彌漫性的炎癥和纖維化,肺泡間隔增厚不明顯。Masson染色可見高劑量組的纖維化程度明顯減少,中、低劑量組纖維化程度亦相應(yīng)減少。另外Szapiel評分結(jié)果顯示復方芒果葉干膏高、中、低劑量組小鼠肺組織的肺泡炎程度均顯著性降低(P0.001),Ashcroft評分結(jié)果顯示復方芒果葉干膏高、中劑量組小鼠肺組織的纖維化程度均顯著性降低(P0.001)。此外,經(jīng)過藥物干預后,復方芒果葉干膏高、中、低劑量組小鼠肺組織中HYP含量顯著性降低(P0.001)。以上提示:復方芒果葉干膏具有保護肺組織,明顯降低肺泡炎、膠原沉積以及肺纖維化的作用�？寡缀涂寡趸�研究作用發(fā)現(xiàn),復方芒果葉干膏高劑量組小鼠肺組織中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量均顯著性降低(P0.001或P0.01);中劑量組小鼠肺組織中IL-6、TNF-α的含量均顯著性降低(P0.001或P0.05)。復方芒果葉干膏高、中、低劑量組小鼠肺組織中丙二醛(Malondialdehyde,MDA)水平顯著性降低(P0.001),超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、總抗氧化能力(Total antioxidant capacity,T-AOC)水平均顯著性升高(P0.001或P0.01或P0.05);高、中劑量組小鼠肺組織中還原型谷胱甘肽(Reduced glutathione,GSH)水平顯著性升高(P0.001)。結(jié)果提示:復方芒果葉干膏對肺纖維化具有良好的抗炎和抗氧化作用。2、復方芒果葉干膏抗肺纖維化機制研究:運用同位素標記相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantification,i TRAQ)蛋白組學技術(shù)對肺纖維化小鼠肺組織進行差異蛋白的定量分析,通過基因本體論(Gene Ontology,GO)、蛋白相鄰類的聚簇(Cluster of Orthologous Groups of proteins,COG)、Pathway等功能注釋以及富集分析來對復方芒果葉干膏抗肺纖維化的機制進行研究。研究結(jié)果顯示,參與復方芒果葉干膏治療肺纖維化的差異蛋白有1700多個,存在于細胞外區(qū)、細胞外間隙、細胞外基質(zhì)、細胞膜、核小體等細胞組分,具有肽酶調(diào)節(jié)活性、酶活抑制、分子結(jié)構(gòu)活性、鈣離子結(jié)合等分子功能,并參與防御反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、凝血系統(tǒng)調(diào)節(jié)等生物過程。復方芒果葉治療肺纖維化的機制可能是通過影響Itgb1、FGF1等73個主要差異蛋白分別作用于PI3K-Akt、Focal adhesion等26條通路發(fā)揮作用,并分別與炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、細胞外基質(zhì)沉積、肌肉收縮以及氧化應(yīng)激等生物過程相關(guān)。以上提示:肺纖維化的發(fā)病機制是一個多靶點蛋白、多信號轉(zhuǎn)導通路、多生物功能因素共同構(gòu)建的復雜生物過程。復方芒果葉可能從抗炎、調(diào)節(jié)免疫、減少細胞外基質(zhì)沉積、緩解肌肉收縮以及抗氧化等生物功能方面對肺纖維化進行治療。3、復方芒果葉干膏化學物質(zhì)組研究:本研究采用超高效液相聯(lián)用四級桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜(Ultra-high Performance Liquid Chromatography-Quadrupole-Time-ofFlight/Mass Spectrometry,UPLC-Q-TOF/MS)分析技術(shù),根據(jù)全掃描質(zhì)譜圖一級質(zhì)譜中測定得到的準分子離子峰,結(jié)合二級質(zhì)譜中的碎片信息分析這些化合物的質(zhì)譜裂解特征,并推測化合物可能的結(jié)構(gòu)式,以此對復方芒果葉干膏的整體化學物質(zhì)基礎(chǔ)進行研究。本研究表征分析出48個化學成分,其中皂苷類化合物26個,二苯甲酮類化合物10個,黃酮類化合物3個,酚酸類化合物5個,蒽醌類化合物3個,香豆素類化合物1個。4、復方芒果葉干膏抗炎物質(zhì)篩選研究及機制預測:本研究利用腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)誘導人支氣管上皮細胞BEAS-2B細胞炎癥模型和建立UPLC/Q-TOF結(jié)合雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)的篩選核轉(zhuǎn)錄因子-κB(Nuclear transcription factor-κB,NF-κB)抑制劑的分析方法,從細胞水平上對復方芒果葉干膏的抗炎活性成分進行篩選鑒定。利用Pharm Mapper、京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)等生物信息手段對鑒定出的抗炎物質(zhì)進行網(wǎng)絡(luò)藥理學研究,預測分析其靶點蛋白和作用通路。最后運用雙熒光素酶和酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)等檢測方法對抗炎成分芒果苷、補骨脂素、人參皂苷Rg1進行活性驗證和協(xié)同作用研究。結(jié)果顯示,復方芒果葉干膏共篩選出16個抗炎成分,包括鳶尾酮酚-3-C-β-D-葡萄糖苷、沒食子酸甲酯、芒果苷、鳶尾酮酚-3-C-(2-O-沒食子�；�)-β-D-葡萄糖苷、2,4’,6-三羥基-4-甲氧基苯甲酮-3-C-β-D-吡喃葡萄糖苷、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、補骨脂素、大黃素甲醚、三七皂苷R2、人參皂苷Rg2、人參皂苷Rh1、人參皂苷Rc、甲基異茜草素-1-甲醚、三七皂苷K。16個抗炎成分分別通過HRAS、MAP2K1等40個靶點作用于炎癥反應(yīng)相關(guān)的MAPK、Focal adhesion等11條通路,其中與復方芒果葉干膏關(guān)聯(lián)性比較高的抗炎通路為MAPK、Focal adhesion、VEGF等通路。以上提示:復方芒果葉干膏是通過多成分、多靶點、多通路來發(fā)揮其抗炎作用。選擇MAPK通路進行進一步研究,網(wǎng)絡(luò)藥理圖顯示,芒果苷(Mangiferin)、補骨脂素(Psoralen)、人參皂苷Rg1(Ginsenoside Rg1)三個化合物與MAPK通路相關(guān),其中芒果苷作用于HRAS、FGFR1;人參皂苷Rg1作用于MAP2K1、BRAF,補骨脂素作用于MAP2K1、FGFR1�；钚则炞C研究顯示,芒果苷、補骨脂素、人參皂苷Rg1可顯著性降低細胞中NF-κB、白細胞介素(IL)-6、IL-8的表達水平(P0.001或P0.01或P0.05)。結(jié)果提示:芒果苷、補骨脂素、人參皂苷Rg1可分別通過MAPK通路發(fā)揮其炎癥抑制作用。協(xié)同增效作用研究顯示,芒果苷與人參皂苷Rg1協(xié)同作用后NF-κB表達水平明顯低于芒果苷或人參皂苷Rg1單獨給藥(P0.01);芒果苷與補骨脂素協(xié)同作用后IL-6表達水平明顯低于芒果苷單獨給藥(P0.01);補骨脂素與人參皂苷Rg1協(xié)同作用后NF-κB、IL-6、IL-8表達水平明顯低于補骨脂素或人參皂苷Rg1單獨給藥(P0.001或P0.01或P0.05)。結(jié)果提示:芒果苷、補骨脂素、人參皂苷Rg1具有良好的協(xié)同抗炎作用�？偨Y(jié):本文首先從整體動物水平上初步證明復方芒果葉干膏具有保護肺組織損傷、抗肺纖維化的作用,其中抑制膠原沉積、抗炎和抗氧化均可能是其發(fā)揮藥效的作用機制。其次從蛋白水平上闡釋復方芒果葉干膏通過多靶點、多通路、多因素發(fā)揮治療肺纖維化的生物學機制,其中抗炎信號通路與治療肺纖維化關(guān)聯(lián)性最大。再次利用UPLC-Q-TOF/MS分析技術(shù)對復方芒果葉干膏進行化學成分表征分析。然后從細胞水平上闡明了復方芒果葉干膏的抗炎物質(zhì)基礎(chǔ),證明其所含的成分具有“協(xié)同所用”。最后,復方芒果葉干膏“成分-靶點-通路”的關(guān)聯(lián)性提示其治療肺纖維化的機制是一個復雜的的生物過程。所以,本研究具有重要的意義和應(yīng)用前景,后續(xù)將按創(chuàng)新藥物的要求進一步細化研究方案,以期將該有效組方開發(fā)成國家六類新藥。
【學位授予單位】：成都中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5
【圖文】：

尼松組、復方芒果葉干膏高、中、低劑量組小鼠肺組織的肺指數(shù)均顯著性降低(P＜0.001)。實驗證明復方芒果葉干膏可濃度依賴性地抑制肺指數(shù)，有效緩解肺纖維化病理病變，見表3、圖1。表3 復方芒果葉干膏對肺纖維化小鼠肺指數(shù)的影響( x ±s, n=10)Table 3 Effect on lung index of dry extract of CML on pulmonary fibrosis in mice ( ±s,n=10)組別 劑量(g/kg) 肺指數(shù)(mg/g)假手術(shù)組 — 5.60±0.22模型組 — 15.90±3.42###潑尼松組 6.67×10-39.60±1.55***復方芒果葉干膏高劑量組 18.0 7.77±2.46***復方芒果葉干膏中劑量組 9.0 8.60±2.47***復方芒果葉干膏低劑量組 4.5 10.47±4.59***注：與假手術(shù)組比較，###表示P＜0.001；與模型組比較，***表示P＜0.001圖1 復方芒果葉干膏對肺纖維化小鼠肺指數(shù)的影響Figure 1 Effect on lung index of dry extract of CML on pulmonary fibrosis in mice

給藥組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，高劑量組較模型組的肺泡炎和肺纖維化明顯減少，未見彌漫性的炎癥和纖維化，肺泡間隔增厚不明顯。中、低劑量組的肺泡炎和纖維化亦不同程度的緩解，見圖2 。圖2 復方芒果葉干膏對肺纖維化小鼠肺組織HE染色(100 )的影響Figure 2 Effect on HE staining(100 ) of dry extract of CML on pulmonary fibrosis in mice3.2.4 Szapiel和Ashcroft評分Szapiel和Ashcroft評分分別是依據(jù)肺組織結(jié)構(gòu)的肺泡炎和纖維沉積情況來進行評判肺組織炎癥和纖維化破壞程度的方法，分別對肺泡炎和肺纖維化進行半定量分析，是目前評斷肺泡炎和肺纖維化較好的指標。Szapiel評分結(jié)果顯示：與假

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本文編號：2736205