發(fā)布時間：2020-06-30 18:09

【摘要】：研究目的:課題組前期發(fā)現(xiàn)lncRNA-ncRuPAR在胃癌組織中的表達(dá)水平顯著低于癌旁組織,且與胃癌的浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腫瘤的大小及TNM分期密切相關(guān),臨床有效方藥“滋陰化痰方”可抑制胃癌細(xì)胞增殖。本課題旨在通過一系列體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)探究ncRuPAR與胃癌增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、凋亡的關(guān)系及其可能的作用機(jī)制,并驗(yàn)證“滋陰化痰方”是否通過干預(yù)ncRuPAR發(fā)揮其對胃癌的治療作用,以期深化對胃癌發(fā)病分子機(jī)制的認(rèn)識,并為闡釋滋陰化痰方可能的作用機(jī)制提供數(shù)據(jù)支持。研究方法:(1)通過實(shí)時熒光定量PCR(Quantitative Real Time PCR,qPCR)技術(shù)檢測AGS,HGC27,MKN45,MGC8034株胃癌細(xì)胞中ncRuPAR的表達(dá)水平。(2)重組慢病毒LV-NCRUPAR(15034-1)和LV-NCRUPAR-CON分別感染HGC27細(xì)胞,構(gòu)建HGC27過表達(dá)細(xì)胞株HGC27-ncRuPAR及對照細(xì)胞株HGC27-Empty Vector;重組慢病毒LV-NCRUPAR-RNAi和LV-NCRUPAR-RNAi-CON分別感染MGC803細(xì)胞構(gòu)建MGC803干擾細(xì)胞株MGC803-ncRuPAR-RNAi及對照細(xì)胞株MGC803-Empty Vector,嘌呤霉素2μg/mL篩選72h后形成慢病毒感染表達(dá)穩(wěn)定株,qPCR檢測各穩(wěn)株中ncRuPAR的表達(dá)量。(3)CCK-8法檢測ncRuPAR對胃癌細(xì)胞HGC27和MGC803增殖的影響;流式細(xì)胞計數(shù)儀分析ncRuPAR對胃癌細(xì)胞HGC27和MGC803周期和凋亡的影響;細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察ncRuPAR對胃癌細(xì)胞HGC27和MGC803遷移能力的影響;Transwell實(shí)驗(yàn)觀察ncRuPAR對胃癌細(xì)胞HGC27和MGC803侵襲能力的影響。(4)將HGC27-ncRuPAR,HGC27-Empty Vector及HGC27-Control細(xì)胞株分別在裸鼠皮下接種造HGC27皮下移植瘤模型,觀察各組裸鼠一般情況及比較瘤體體積和質(zhì)量,比較ncRuPAR對HGC27皮下移植瘤裸鼠腫瘤生長的影響。(5)Affymetrix基因表達(dá)譜芯片技術(shù)篩選HGC27-ncRuPAR細(xì)胞株和HGC27-Empty Vector細(xì)胞株之間差異表達(dá)基因,并將芯片分析的差異基因結(jié)果進(jìn)行IPA(Ingenuity Pathway Anaylsis,IPA)分析,推測ncRuPAR影響胃癌細(xì)胞增殖凋亡的可能通路;Western blot實(shí)驗(yàn)檢測ncRuPAR對HGC27和MGC803細(xì)胞中PAR-1蛋白及PI3K/Akt信號通路及其下游蛋白CyclinD1和Bcl-2表達(dá)的影響。(6)中藥“滋陰化痰方”干預(yù)HGC27和MGC803細(xì)胞株,CCK-8法檢測細(xì)胞增殖變化,觀察滋陰化痰方對胃癌細(xì)胞增殖的影響;流式細(xì)胞計數(shù)儀分析滋陰化痰方對胃癌細(xì)胞HGC27和MGC803周期和凋亡的影響;qPCR檢測滋陰化痰方對胃癌細(xì)胞ncRuPAR表達(dá)的影響,觀察滋陰化痰方是否對ncRuPAR的表達(dá)存在調(diào)控作用;Western blot驗(yàn)證滋陰化痰方對PAR-1蛋白及PI3K/Akt信號通路及其下游蛋白CyclinD1和Bcl-2表達(dá)的影響,探究滋陰化痰方可能的作用機(jī)制。結(jié)果:(1)qPCR結(jié)果顯示:ncRuPAR在HGC27細(xì)胞中低表達(dá),在MGC803細(xì)胞中高表達(dá)。(2)選擇HGC27細(xì)胞構(gòu)建ncRuPAR過表達(dá)穩(wěn)定株,選用MGC803細(xì)胞構(gòu)建ncRuPAR干擾穩(wěn)定株,qPCR驗(yàn)證ncRuPAR過表達(dá)及干擾穩(wěn)株構(gòu)建成功。(3)CCK-8和流式細(xì)胞周期結(jié)果顯示:過表達(dá)ncRuPAR可抑制HGC27細(xì)胞的增殖,使細(xì)胞周期阻滯于G1期,并促進(jìn)其凋亡,而干擾ncRuPAR表達(dá)則抑制MGC803細(xì)胞增殖、減少細(xì)胞凋亡。劃痕實(shí)驗(yàn)和transwells實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:ncRuPAR對胃癌細(xì)胞HGC27和MGC803的遷移及侵襲能力影響不顯著。(4)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,HGC27-ncRuPAR組與對照組相比,實(shí)驗(yàn)組裸鼠成瘤減慢,瘤體減小。(5)Western blot結(jié)果顯示:過表達(dá)ncRuPAR使HGC27細(xì)胞中PAR-1、PI3K、p-Akt、CyclinD1蛋白的表達(dá)下降;而干擾ncRuPAR則可使MGC803細(xì)胞中PAR-1、PI3K、p-Akt、CyclinD1蛋白的表達(dá)升高。(6)中藥“滋陰化痰方”作用于胃癌HGC27和MGC803細(xì)胞,CCK-8和流式細(xì)胞周期結(jié)果顯示:中藥“滋陰化痰方”可以抑制細(xì)胞增殖,阻滯細(xì)胞周期并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;qPCR結(jié)果顯示滋陰化痰方可以增加胃癌細(xì)胞中ncRuPAR的表達(dá);Western blot結(jié)果顯示滋陰化痰方可以抑制PI3K、p-Akt、CyclinD1和Bcl-2蛋白的表達(dá)。結(jié)論:ncRuPAR可通過下調(diào)PAR-1的表達(dá)和抑制PI3K/Akt通路發(fā)揮其抑制胃癌細(xì)胞增殖及促凋亡作用。上調(diào)ncRuPAR的表達(dá)和抑制PI3K/Akt通路是中藥“滋陰化痰方”抑制腫瘤細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的可能分子機(jī)制之一。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5
【圖文】：

1 四種胃癌細(xì)胞中 ncRuPAR 表達(dá)柱狀圖（nuPAR 過表達(dá)/干擾穩(wěn)定株的構(gòu)建RUPAR（15034-1）和 LV-NCRUPAR-CON 分cRuPAR組與HGC27-Empty Vector組；慢病毒V-NCRUPAR-RNAi-CON 分 別 感 染 MGC8-RNAi 組和 MGC803-Empty Vector 組。兩個和 MGC803-Control 組。嘌呤霉素 2μg/mL 篩PAR 的表達(dá)量，結(jié)果顯示：HGC27-ncRuPARmpty-Vector 組和 HGC27-Control 組，差異具RuPAR 細(xì)胞中 ncRuPAR 表達(dá)量低于 MGC8，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05）（圖 2），說株構(gòu)建成功。

圖 1 四種胃癌細(xì)胞中 ncRuPAR 表達(dá)柱狀圖（n=3）（二）ncRuPAR 過表達(dá)/干擾穩(wěn)定株的構(gòu)建慢病毒 LV-NCRUPAR（15034-1）和 LV-NCRUPAR-CON 分別感染 HGC27 細(xì)記為HGC27-ncRuPAR組與HGC27-Empty Vector組；慢病毒LV-NCRUPAR-R4387-1 ） 和 LV-NCRUPAR-RNAi-CON 分 別 感 染 MGC803 細(xì) 胞 并 標(biāo) 記C803-ncRuPAR-RNAi 組和 MGC803-Empty Vector 組。兩個空白對照組分別標(biāo)GC27-Control 組和 MGC803-Control 組。嘌呤霉素 2μg/mL 篩選后，qPCR 分別組細(xì)胞中 ncRuPAR 的表達(dá)量，結(jié)果顯示：HGC27-ncRuPAR 細(xì)胞中 ncRuPAR高于 HGC27-Empty-Vector 組和 HGC27-Control 組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（）；MGC803-ncRuPAR 細(xì)胞中 ncRuPAR 表達(dá)量低于 MGC803-EmptyVector 組C803-Control 組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05）（圖 2），說明 HGC27 過表達(dá)C803 干擾穩(wěn)定株構(gòu)建成功。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2735645