發(fā)布時間：2020-03-21 19:49

【摘要】：黃芩苷(baicalin,BA)是從唇形科植物黃芩(Scutellaria baicalensis Georgi)的干燥根莖中提取分離出來的一種黃酮類化合物,其生物活性顯著,具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用。BA分子結(jié)構(gòu)中黃酮和葡萄苷酸之間可以形成分子內(nèi)氫鍵,導(dǎo)致其水溶性和脂溶性均較差,口服生物利用度僅為2.2%,從而臨床應(yīng)用得到一定限制。固體脂質(zhì)納米粒(solid lipid nanoparticles,SLN)是粒徑在10-1000 nm范圍內(nèi)的微粒給藥體系,其特點包括毒性低、生物相容性好、生物可降解性,同時具有很好的靶向性,SLN用以包裹難溶性藥物從而提高其體內(nèi)吸收。前期課題組為了提高BA的口服生物利用度,將其載進SLN,制備了黃芩苷固體脂質(zhì)納米粒(BA SLN)。SLN可提高BA的生物利用度,改善BA的吸收,然而SLN提高BA吸收的機制尚不明確,國內(nèi)外關(guān)于BA SLN口服吸收機制的研究較少。小腸吸收是藥物吸收過程中關(guān)鍵步驟。最常用到的模型是人結(jié)腸腺癌Caco-2細胞模型。Caco-2細胞經(jīng)過一段時間培養(yǎng)后,其形態(tài)學(xué)、標志酶表達、攝取轉(zhuǎn)運及滲透特征均與小腸上皮細胞類似,所以常被用于藥物經(jīng)小腸上皮細胞吸收機制的研究。本課題在既往工作基礎(chǔ)上,建立Caco-2細胞攝取和轉(zhuǎn)運模型,考察BA及BA SLN在腸上皮細胞的攝取轉(zhuǎn)運特性,初步闡釋SLN提高BA小腸吸收的機制,以期為BA SLN的處方設(shè)計提供理論依據(jù)。目的:探究BA及BA SLN在Caco-2細胞模型中攝取特性和轉(zhuǎn)運機理,初步闡明BA及BA SLN經(jīng)腸上皮細胞的吸收機制。方法:建立體外Caco-2細胞攝取和轉(zhuǎn)運模型,觀察細胞形態(tài),跨膜電阻值(TEER)和頂端側(cè)(AP)與基底側(cè)(BL)的堿性磷酸酶(ALP)的活性比值檢測細胞單層的致密性和極化特征;利用CCK-8法和LDH法檢測BA及BA SLN對Caco-2細胞的毒性,篩選出安全的給藥濃度;建立細胞中BA的含量測定方法,并進行方法學(xué)驗證;通過研究時間、濃度、溫度和內(nèi)吞抑制劑對BA和BA SLN的Caco-2細胞攝取量的影響探究BA和BA SLN入胞方式及攝取特性;轉(zhuǎn)運實驗檢測出BA及BA SLN在Caco-2細胞上的表觀滲透系數(shù)(Papp)和外排率(ER);激光共聚焦顯微鏡檢測Zona occluding-1(ZO-1)的分布;采用P-糖蛋白(P-gp)、多藥耐藥相關(guān)蛋白2(MRP2)和乳腺癌耐藥蛋白(BCRP)蛋白抑制劑研究外排轉(zhuǎn)運蛋白對BA和BA SLN的轉(zhuǎn)運影響;Western blotting法檢測ZO-1、P-gp、MRP2和BCRP蛋白的表達。結(jié)果:1.Caco-2細胞攝取、轉(zhuǎn)運模型的建立及毒性檢測Caco-2細胞培養(yǎng)5-7天左右,在倒置顯微鏡下觀察,基本達到融合,邊界清楚,呈鋪路石狀;培養(yǎng)至14天,形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示細胞均勻、致密。Caco-2細胞單層TEER隨培養(yǎng)時間的延長而增高,17及21天時,TEER值分別為545.84Ω·cm~2、556.98Ω·cm~2;此細胞模型AP側(cè)與BL側(cè)的ALP活性比值隨培養(yǎng)時間的延長而增高,培養(yǎng)14及21天時,其比值分別為5.05±0.09、9.10±0.25,可用于細胞轉(zhuǎn)運實驗。CCK-8法檢測BA及BA SLN對Caco-2細胞的毒性,隨著藥物濃度的增加,細胞存活率有降低趨勢;當BA及BA SLN濃度在0-150μg/mL時,孵育24 h后細胞存活率均與空白組沒有顯著差異;LDH法檢測細胞膜的完整性,在0-150μg/mL濃度范圍內(nèi),乳酸脫氫酶的釋放率無明顯變化;藥物濃度達到150μg/mL以上,乳酸脫氫酶釋放率明顯增加。2.黃芩苷固體脂質(zhì)納米粒在Caco-2細胞模型中的攝取特性藥物濃度為150μg/mL時,0-1 h內(nèi)BA及BA SLN在Caco-2細胞攝取量隨時間延長而增加。0-150μg/mL系列濃度的BA及BA SLN在Caco-2細胞中攝取1 h,攝取量隨濃度的增加而增大,且每個濃度下,BA SLN溶液的細胞攝取量均顯著高于BA溶液。藥物濃度為150μg/mL時,分別于4°C和37°C下孵育1 h,BA及BA SLN在Caco-2細胞中攝取量隨溫度升高而明顯增加。當內(nèi)吞抑制劑β-環(huán)糊精和氯丙嗪存在時,BA在Caco-2細胞上的攝取量沒有明顯的變化,而BA SLN在Caco-2細胞上的攝取量明顯減少。3.黃芩苷固體脂質(zhì)納米粒在Caco-2細胞模型中的轉(zhuǎn)運機制與BA組相比,BA SLN組在Caco-2細胞單層由AP到BL的Papp顯著增加,ER顯著下降;BA組和BA SLN組的細胞間緊密連接蛋白ZO-1呈現(xiàn)連續(xù)狀,且與空白組相比,BA組和BA SLN組的ZO-1蛋白的表達無顯著差異;MRP2蛋白抑制劑MK-571和BCRP蛋白抑制劑KO-143可降低BA的外排率,而BA SLN則不受外排蛋白抑制劑的影響;與空白組相比,BA對外排蛋白MRP2和BCRP的表達無顯著影響,BA SLN則顯著降低外排蛋白MRP2和BCRP蛋白的表達。結(jié)論:1、Caco-2細胞攝取和轉(zhuǎn)運模型建立成功;BA及BA SLN作用于細胞的安全濃度范圍為0-150μg/mL。2、BA在Caco-2細胞上的攝取方式為被動擴散和主動轉(zhuǎn)運;BA SLN在Caco-2細胞上的攝取存在著被動擴散和主動轉(zhuǎn)運,且受內(nèi)吞抑制劑影響,BA SLN可通過內(nèi)吞的方式入胞,從而增加BA攝取量。3、BA SLN顯著增加了BA的跨膜轉(zhuǎn)運能力,BA SLN無法打開細胞間的緊密連接,其增加藥物跨膜轉(zhuǎn)運的能力與細胞旁路途徑無關(guān)。BA易受到外排蛋白MRP2和BCRP的作用被細胞外排導(dǎo)致吸收較差,將BA載入SLN后,BA SLN可避開了此類外排蛋白的外排作用,從而減少藥物的外排。
【圖文】：

細胞長到第 5-7 d 時，進行細胞傳代。將培養(yǎng)兩次，用 1 mL 胰蛋白酶消化，待細胞脫落收集細胞，用新鮮的培養(yǎng)液吹散，分為 5 瓶細胞消化收集好后，加 1.8 mL 血清和 0.2 m封蓋。4 °C 冰箱放置 30 min，20 °C 冰箱放將凍存管放入液氮罐中保存。觀察：在熒光倒置顯微鏡下觀察，剛消化傳代的全部貼壁，第 3 天時，細胞數(shù)量明顯增加， 7 天時，細胞基本達到融合，均勻、致密，

每天換液，培養(yǎng)至 14 天，細胞形態(tài)融合，均勻、致密，邊，先棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入 37 °C 的 PBS 溶液 2 mL，孵育 20然后用 PBS 輕輕蕩洗一次。處理后的 Caco-2 細胞，可用于后續(xù)攝co-2 細胞轉(zhuǎn)運單層模型的建立與表征細胞按 1×105個/mL 接種到 Transwell 小室內(nèi)，如圖 2 所示，，頂端側(cè)5 mL 細胞混懸液，基底側(cè)（BL）加入 1.5 mL 完全培養(yǎng)液。接種天換液一次，一周后每天換液，培養(yǎng)至 21 d。于實驗室的培養(yǎng)條件不同，造成形成的 Caco-2 細胞單分子層具有了保證培養(yǎng)的 Caco-2 細胞能夠很好的模擬小腸上皮細胞的吸收 Caco-2 細胞進行相關(guān)指標的檢測是有必要的。本研究用跨膜電阻值磷酸酶（APL）的活性兩個指標進行檢驗，判斷 Caco-2 細胞模型5]。
【學(xué)位授予單位】：安徽中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 張_,郭俊生,秦海宏;高濃度鋅對Caco-2細胞生長的影響[J];解放軍預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志;2004年06期

2 龔濤;范遠景;王明和;劉培志;徐柳;楊登玲;;納米三羥異黃酮Caco-2細胞吸收實驗[J];合肥工業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2018年11期

3 王明星;張艷秋;肖旭朗;;基于H_2O_2誘導(dǎo)Caco-2細胞模型的猴頭菌多糖抗?jié)�瘍性結(jié)腸炎活性研究[J];時珍國醫(yī)國藥;2017年10期

4 王曉東;李秋霞;;Caco-2細胞單層模型中新穿心蓮內(nèi)酯的吸收機制觀察[J];山西醫(yī)藥雜志;2018年14期

5 田莉;郭閃;賀元;張愛榮;孫晶;;芹菜素在Caco-2細胞中轉(zhuǎn)運特性的研究[J];新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2019年09期

6 王素蓮;黃僺;楊發(fā)有;黃偉;熊玉卿;夏春華;胡曉;;藏花酸在Caco-2細胞模型中的吸收轉(zhuǎn)運研究[J];中國臨床藥理學(xué)雜志;2018年15期

7 黃璐瑤;梁鵬;;基于Caco-2細胞模型評價食品營養(yǎng)物質(zhì)的研究進展[J];農(nóng)產(chǎn)品加工;2018年06期

8 雷艷青;李煥德;;Caco-2細胞培養(yǎng)、細胞單層模型建立的研究[J];臨床合理用藥雜志;2018年20期

9 陸敏;孫銀強;袁琳;胡娜;林敏;鐘霄毓;刁琪龍;李碩;方龍娟;姜逸;陸雄;;Caco-2細胞單層模型形態(tài)學(xué)的電鏡評價[J];電子顯微學(xué)報;2018年04期

10 牛美蘭;裴巖巖;王鵬;范媛媛;陳長英;王世廣;袁武;;網(wǎng)格蛋白內(nèi)吞途徑在輪狀病毒感染對Caco-2細胞鈉氫交換蛋白3調(diào)控中的作用[J];中國感染與化療雜志;2018年06期

相關(guān)會議論文 前10條

1 張想軍;周學(xué)章;;糞腸球菌與大腸桿菌共培養(yǎng)后對Caco-2細胞粘附入侵的影響[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會獸醫(yī)藥理毒理學(xué)分會第十五次學(xué)術(shù)討論會論文集[C];2019年

2 廖躍華;劉銀麗;樂健;洪戰(zhàn)英;;基于Caco-2細胞模型的元胡白芷藥對轉(zhuǎn)運特性及配伍影響研究[A];2016年中國藥學(xué)大會暨第十六屆中國藥師周論文集[C];2016年

3 張露瀠;趙健;錢波;曾榛;趙超超;宋家樂;;芥子酸對LPS所致Caco-2細胞炎癥反應(yīng)及其通透性的作用研究[A];第十四屆全國營養(yǎng)與保健食品科學(xué)大會暨研發(fā)科技創(chuàng)新專題研討會會議論文匯編[C];2018年

4 朱安;高亞東;趙經(jīng)緯;王旗;;千金子素致Caco-2細胞毒性的轉(zhuǎn)錄組分析[A];中國毒理學(xué)會中藥與天然藥物毒理與安全性評價第四次（2019年）學(xué)術(shù)年會論文集[C];2019年

5 高浩祥;曾維才;;粗壯女貞苦丁茶對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用[A];中國食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會第十三屆年會論文摘要集[C];2016年

6 程曉華;熊玉卿;徐文煒;張紅;溫金華;蔡軍;張麗芳;;熊果酸體外吸收及代謝機制的研究[A];中國藥理學(xué)會第九次全國會員代表大會暨全國藥理學(xué)術(shù)會議論文集[C];2007年

7 李崢;莊笑梅;李素云;張振清;阮金秀;;P-糖蛋白與藥物相互作用模型的建立及其在藥物評價中的應(yīng)用[A];第九屆全國藥物和化學(xué)異物代謝學(xué)術(shù)會議論文集[C];2009年

8 張_;李正銀;;高鋅對Caco-2細胞鐵、鋅含量及其調(diào)控基因mRNA表達的影響[A];上海市預(yù)防醫(yī)學(xué)會第二屆學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2006年

9 黃怡;黃琴;李衛(wèi)芬;余東游;周緒霞;;鼠李糖乳桿菌對Caco-2細胞抗氧化功能和細胞因子分泌的影響[A];第四屆第十次全國學(xué)術(shù)研討會暨動物微生態(tài)企業(yè)發(fā)展戰(zhàn)略論壇論文集（上冊）[C];2010年

10 李云濤;釗守梅;朱葉萌;韓新燕;汪以真;;殼聚糖銅在Caco-2細胞模型中吸收與轉(zhuǎn)運的研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會動物營養(yǎng)學(xué)分會第十一次全國動物營養(yǎng)學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2012年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 閆中天;口服去羥肌苷擬肽類前藥的研究[D];沈陽藥科大學(xué);2010年

2 方平飛;基于與轉(zhuǎn)運蛋白P-gp相互作用的抗結(jié)核藥物耐藥機制研究[D];中南大學(xué);2010年

3 張又夕;口服地西他濱擬肽類前藥的設(shè)計與評價[D];沈陽藥科大學(xué);2013年

4 姜麗;基于理化性質(zhì)—藥效—體內(nèi)外吸收評價葛根素和天麻素配伍應(yīng)用的合理性[D];北京中醫(yī)藥大學(xué);2013年

5 李崢;P-糖蛋白與藥物相互作用模型的建立及其在藥物評價中的應(yīng)用[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2009年

6 查龍應(yīng);不同化學(xué)形式三價鉻腸道吸收機理的研究[D];浙江大學(xué);2007年

7 高東雁;丹參酚酸磷脂復(fù)合物及其自乳化給藥系統(tǒng)研究[D];復(fù)旦大學(xué);2009年

8 吳建明;皂莢抗心肌缺血活性成分篩選及機理研究[D];成都中醫(yī)藥大學(xué);2008年

9 顏苗;甘草酸18位差向異構(gòu)體及其水解產(chǎn)物對P-糖蛋白影響的研究[D];中南大學(xué);2010年

10 馬文強;甘氨酸亞鐵螯合物的腸道吸收特點及其生物學(xué)效應(yīng)研究[D];浙江大學(xué);2010年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 歐陽怡;黃芩苷固體脂質(zhì)納米粒在Caco-2細胞模型中吸收機制的研究[D];安徽中醫(yī)藥大學(xué);2019年

2 黃魯燕;利用Caco-2細胞模型評價益生元發(fā)酵上清生理功效方法的優(yōu)化及應(yīng)用[D];上海交通大學(xué);2018年

3 吳青;PEPT1對朱砂在Caco-2細胞模型中轉(zhuǎn)運的影響[D];遵義醫(yī)科大學(xué);2019年

4 江萍;基于Caco-2細胞模型的乳清蛋白納米載體提高姜黃素吸收率的研究[D];北京化工大學(xué);2018年

5 蘇繼源;痰瘀同治方藥抑制人結(jié)腸腺癌Caco-2細胞膽汁酸吸收的機制研究[D];中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué);2018年

6 周慧敏;利用Caco-2細胞模型研究腸道可吸收乳清肽的結(jié)構(gòu)特征[D];南京師范大學(xué);2015年

7 黃晶晶;基于靜電紡納米纖維膜的Caco-2細胞模型構(gòu)建及其槲皮素吸收機制研究[D];浙江工商大學(xué);2019年

8 馮國雪;鈣結(jié)合葵花籽肽、花生肽的結(jié)構(gòu)表征及對Caco-2細胞促鈣轉(zhuǎn)運作用研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

9 謝璐娜;番鴨腸道乳酸菌篩選鑒定、抑菌作用及對Caco-2細胞粘附的影響[D];福建農(nóng)林大學(xué);2015年

10 王愛娟;薄荷醇在Caco-2細胞模型中的促吸收機制研究[D];廣東藥科大學(xué);2017年

本文編號：2593847