發(fā)布時間：2020-03-21 17:00

【摘要】：目的:膽管癌(Cholangiocarcinoma,CCA)是一種常見的膽道惡性腫瘤,惡性程度高,預(yù)后極差,約占消化道腫瘤中的3%,其發(fā)病率與死亡率逐年上升。目前膽管癌治療原則仍采用手術(shù)切除為主的綜合治療方案,但確診時僅有不足1/3的患者可行手術(shù)切除,且手術(shù)預(yù)后差,聯(lián)合化療對局部晚期或轉(zhuǎn)移性不可切除膽管癌效果也不理想,迫切需要開發(fā)新的多學(xué)科綜合治療手段和治療藥物,從而改善膽管癌患者的預(yù)后。姜黃素,中藥姜黃中提取的天然成分,具有抗腫瘤、抗氧化和抗炎等多種生物活性,但是由于其化學(xué)不穩(wěn)定及生物利用度低等缺點,限制了其臨床應(yīng)用。本論文通過對姜黃素的不穩(wěn)定基團改造,得到了化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的單羰基姜黃素類似物WZ26,并對WZ26進行了初步的抗膽管癌藥理活性篩選,發(fā)現(xiàn)WZ26顯示出很好的抗膽管癌活性。因此本論文將進一步深入的研究WZ26的體內(nèi)外抗膽管癌的作用及機制。方法:1、姜黃素類似物WZ26的體外抗腫瘤活性及機制研究以姜黃素為先導(dǎo)化合物,設(shè)計合成了結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的單羰基姜黃素類似物WZ26,通過MTT法測定了化合物WZ26在三種不同膽管癌細(xì)胞株中的抗腫瘤活性,通過流式細(xì)胞儀研究了化合物WZ26在膽管癌細(xì)胞周期阻滯和誘導(dǎo)凋亡中的作用。通過Western-blotting法研究了WZ26對凋亡、周期相關(guān)蛋白Pro-caspase3、CDC和Cyclin B1的影響。通過Western-blotting、流式細(xì)胞儀和透射電鏡等方法,研究了WZ26對膽管癌細(xì)胞周期阻滯和誘導(dǎo)凋亡的作用是否與細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平有關(guān)。另外,還通過Western-blotting、侵襲和遷移等實驗方法,探討了WZ26抗膽管癌細(xì)胞高侵襲性的機制。2、姜黃素類似物WZ26的體內(nèi)抗腫瘤活性及機制研究通過建立膽管細(xì)胞癌QBC-939細(xì)胞株的BALB/c A裸鼠皮下瘤模型,運用Western-blotting、免疫組化、免疫熒光等手段來驗證化合物WZ26體內(nèi)抗腫瘤藥理藥效及初步探討其作用機制。結(jié)果:一、姜黃素類似物WZ26的體外抗腫瘤活性及機制研究1、WZ26對膽管癌細(xì)胞(RBE、QBC-939、HUCCA)的半數(shù)抑制率IC50都較姜黃素小,即WZ26對膽管癌細(xì)胞生長的抑制活性較姜黃素好。2、WZ26劑量(5,10,20μM)依賴性地促進膽管癌細(xì)胞株(RBE、QBC-939、HUCCA)凋亡,同時也誘導(dǎo)膽管癌細(xì)胞周期阻滯在G2/M期。3、機制上WZ26通過升高QBC-939細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平,可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和周期阻滯,而ROS抑制劑NAC可以逆轉(zhuǎn)以上改變。4、通過JC-1免疫熒光方法,觀測到化合物WZ26加入后,由于線粒體膜電位的衰竭,熒光由紅色變成綠色。電鏡觀測線粒體的形態(tài)學(xué),看到WZ26作用后QBC-939細(xì)胞線粒體內(nèi)膜脊結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞導(dǎo)致線粒體腫脹,在超微結(jié)構(gòu)上證明線粒體膜發(fā)生破壞。5、用免疫熒光法檢測QBC-939細(xì)胞中細(xì)胞色素C由線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)情況。結(jié)果顯示在WZ26(15μM)處理細(xì)胞24h后,細(xì)胞色素C從線粒體中釋放到細(xì)胞質(zhì)中,紅色熒光從綠色熒光中擴散出來。WZ26(15μM)處理24h后Caspase9的活性也明顯增加。6、Western blottingting結(jié)果顯示W(wǎng)Z26作用于QBC-939細(xì)胞后時間和劑量依賴性抑制了STAT3的激活。7、劃痕實驗,Transwell,PCR和Western blottingting結(jié)果說明WZ26可以抑制TNF-α誘導(dǎo)的QBC-939細(xì)胞的遷移、浸潤和抑制TNF-α誘導(dǎo)的QBC-939細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。8、Western blottingting結(jié)果顯示W(wǎng)Z26還可抑制QBC-939細(xì)胞內(nèi)TNF-α和LPS誘導(dǎo)的STAT3通路的激活。二、姜黃素類似物WZ26的體內(nèi)抗腫瘤活性及機制研究研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)WZ26通過升高腫瘤組織內(nèi)活性氧水平,誘導(dǎo)線粒體損傷和細(xì)胞凋亡,明顯抑制小鼠QBC-939細(xì)胞皮下瘤生長。1、從體重和腫瘤數(shù)據(jù)可以看到,給藥組和對照組裸鼠的體重沒有明顯的差異,說明藥物對裸鼠基本無毒。從腫瘤體積圖中可以明顯看到,裸鼠給藥WZ26后,腫瘤體積減小,說明WZ26能夠抑制膽管癌QBC-939細(xì)胞生長。2、從Western blottingting結(jié)果可以看到,在腫瘤組織中促凋亡蛋白Cleaved-caspase3表達(dá)增加,說明WZ26在體內(nèi)也能夠促進膽管癌QBC-939細(xì)胞的凋亡。3、從免疫組化結(jié)果可以看到,與增殖相關(guān)的蛋白Ki67在給藥組表達(dá)減少,說明WZ26抑制了裸鼠體內(nèi)膽管癌QBC-939細(xì)胞的增殖。結(jié)論:本文通過對WZ26的體內(nèi)外抗膽管癌的作用及機制研究發(fā)現(xiàn),WZ26一方面通過升高膽管癌細(xì)胞中的氧化應(yīng)激水平,從而激活線粒體凋亡通路來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并阻滯細(xì)胞周期;另一方面通過抑制STAT3的磷酸化,抑制膽管癌細(xì)胞侵襲、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)從而發(fā)揮抗膽管癌的作用。WZ26很有潛力成為膽管癌治療中的新一類候選藥物。同時,我們的研究也表明,靶向ROS水平和抑制炎癥因子的表達(dá)有可能成為治療膽管癌的重要策略。但是目前對該化合物作用靶點以及深入的抗膽管癌機制沒有十分明確,有待于進一步探討。
【圖文】：

3.1 WZ26 的結(jié)構(gòu)和抑制膽管癌細(xì)胞的生存率通過對姜黃素的結(jié)構(gòu)改造，去除其不穩(wěn)定基團，我們得到姜黃素單羰基類似物WZ26，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖 3-1A。以姜黃素為陽性對照，用 MTT 法檢測了 WZ26 對三種膽管癌細(xì)胞（RBE，QBC-939，HUCCA）生存率的影響。WZ26（濃度為 0.625，1.25，2.5，5，10，20μM）孵育膽管癌細(xì)胞 24 小時，實驗結(jié)果顯示 WZ26 可以劑量依賴性地降低膽管癌細(xì)胞的生存率，其中對測定的 RBE，QBC-939 和 HUCCA 細(xì)胞的 IC50 值分別為 4.7μM，4.8μM 和 4.2μM, 姜黃素對應(yīng) IC50 值分別為＞20μM，8.9μM和 10.8μM（圖 3-1-B-C）。這表明 WZ26 明顯抑制膽管癌細(xì)胞的生存率，作用效果要優(yōu)于姜黃素。同時，我們用 MTT 實驗對 WZ26 的毒性做了評估，WZ26 對正常膽管上皮細(xì)胞（HIBEC）的 IC50 值＞20μM（圖 3-1-B），這進一步表明 WZ26 可以選擇性的抑制膽管癌細(xì)胞的生存率，對正常細(xì)胞影響較小，安全性高。

WZ26誘導(dǎo)膽管癌細(xì)胞凋亡和周期阻滯A.WZ26（5，，10和15μM）分別處理膽管癌細(xì)胞RBE，QBC-939，HUCCA細(xì)胞24HUCCAQBC-939
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285

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本文編號：2593646