發(fā)布時間：2020-03-21 01:34

【摘要】：目的:觀察溫陽活血利水法對氨基核苷嘌呤霉素損傷的小鼠永生性足細胞發(fā)動蛋白(Dynamin)表達的影響,探討溫陽活血利水方降低尿蛋白的作用機制。方法:1.制備溫陽活血利水方的中藥含藥血清。2.細胞培養(yǎng)、傳代和誘導分化成熟的足細胞,用濃度為45mg/L的嘌呤霉素損傷足細胞,并用溫陽活血利水方中藥血清進行干預,以糖皮質(zhì)激素地塞米松干預作為陽性對照,并設正常對照和中藥空白對照,分組如下:A:正常對照組、B:嘌呤霉素(45mg/L)組/模型組、C:地塞米松(1μmol/L)組、D:10%的中藥血清組、E:20%的中藥血清組、F:中藥血清空白對照組。3.實時定量PCR檢測各組足細胞組織蛋白酶(Cat L)m RNA和足細胞發(fā)動蛋白(dynamin)m RNA的相對表達量。4.Western blot檢測各組足細胞組織蛋白酶(Cat L)和足細胞發(fā)動蛋白(dynamin)的蛋白表達。5.免疫熒光染色結合激光共聚焦技術觀察溫陽活血利水中藥方對嘌呤霉素造成的足細胞損傷模型中足細胞細胞骨架結構微絲(microfilaments)、微管(microtubule)的形態(tài)結構變化以及足細胞組織蛋白酶(Cat L)和足細胞發(fā)動蛋白(dynamin)的表達變化。結果:1.RT-PCR實驗顯示:模型組的CatL m RNA表達含量比正常組高(P0.01);與模型組比較,中藥組與地塞米松組Cat L m RNA表達含量降低(均P0.01);10%與20%中藥組與地塞米松組相比,Cat L m RNA無差異(P0.01);10%中藥組Cat L m RNA表達較20%中藥組高(P0.01);實驗中6個分組足細胞Dynamin m RNA相對表達量無組間差異(P0.01)。2.免疫熒光顯示:與正常組比較,模型組的Cat L熒光強度增強,Dynamin熒光強度減弱;與模型組比較,中藥血清組和地塞米松組Cat L蛋白熒光減弱,而Dynamin熒光增強。3.Western blot顯示:與正常組比較,模型組的Cat L表達升高,Dynamin表達降低(均P0.01);與模型組比較,中藥組和地塞米松組Cat L表達降低,Dynamin表達升高(均P0.01);與地塞米松組比較,兩中藥組Cat L表達無差異(P0.01),而10%中藥組Dynamin表達較低,20%中藥組Dynamin表達較高(均P0.01);兩中藥組之間比較,10%中藥組Cat L表達較高,Dynamin表達較低(均P0.01);中藥血清空白對照組與正常組比較,Cat L與Dynamin均無差異(P0.01)。4.微絲、微管的免疫熒光結果:與正常組比較,模型組細胞胞體縮小、偽足回縮,細胞骨架結構微絲形成的張力纖維出現(xiàn)了由協(xié)調(diào)有序的平行排列模式重組變成了紊亂無序的放射網(wǎng)狀結構、微絲數(shù)量減少,并且趨于邊緣化形成核外環(huán),與此同時細胞骨架結構微管出現(xiàn)了數(shù)量減少、解聚、排列紊亂,但在足細胞初級突起處分布數(shù)量有所增加;在中藥血清組和地塞米松組均可以觀察到足細胞形態(tài)、骨架蛋白結構有所改善。結論:溫陽活血利水方中藥血清會使嘌呤霉素誘導的小鼠永生化足細胞損傷模型中足細胞組織蛋白酶Cat L表達減少,足細胞發(fā)動蛋白Dynamin含量增加,但Dynamin基因的相對表達量無明顯改變,并糾正細胞肌動蛋白的骨架重構和微管的排列紊亂。溫陽活血利水法可能是通過下調(diào)足細胞Cat L的表達而減少Cat L對足細胞Dynamin的裂解,從而穩(wěn)定細胞骨架中的微絲、微管等結構,維持足細胞的形態(tài),減少足突融合以使蛋白尿得以改善。
【圖文】：

. 氨基核苷嘌呤霉素對足細胞微絲、微管的作用以及溫陽活血利響腎小球足細胞高度分化，是腎臟濾過裝置的重要組成部分。細胞骨架是其保持動態(tài)細胞結構的基礎，在適當?shù)淖慵毎�功能中要作用。細胞骨架主要有三種結構，微絲、微管和中間絲，它們、彼此依賴，共同構成細胞的支架結構，對細胞內(nèi)外的各種細胞胞分裂、細胞遷移、細胞內(nèi)物質(zhì)運輸、細胞粘附等）調(diào)控均有重足細胞中這三種結構的分布是：細胞胞體和初級突起內(nèi)的骨架結(microtubule)和中間絲(intermediate filaments)為主，次級濾過膜的組成結構之一，習慣直接稱之為足突）的骨架結構則icrofilament)為主[34]。

圖 2：微管、中間絲、微絲之間聯(lián)系腎小球的足細胞暴露于血液濾過壓力之中，其與基底膜的有效連接對維持濾過功能至關重要，粘著斑是足細胞與基底膜連接和細胞外環(huán)境作用的必要結構之一。對胃癌細胞的新近研究表明，粘著斑激酶與細胞的微管、微絲分布有關，可見微絲、微管與粘著斑存在某種關聯(lián)[43]。另外，一項對足細胞發(fā)動蛋白 Dynamin 的研究顯示，Dynamin 與微管存在某種關聯(lián)，Dynamin 的缺失會導致微管蛋白乙�；�水平急劇增加[23]。結合本次實驗中溫陽活血利水方對損傷足細胞微管的修復以及對 Dynamin 的保護作用，我們推測該中藥方可以通過降低損傷足細胞中 CatL 的表達，，減少 CatL 對Dynamin 的裂解，減少因 dynamin 缺失造成的微管蛋白的破壞，從而保護dynamin 與微絲結構的良性互動，修復損傷足細胞中微絲、微管結構，保護粘著斑結構功能的完整，從而使足細胞穩(wěn)定地附著于基底膜，維持腎小
【學位授予單位】：湖北中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285

【參考文獻】

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本文編號：2592523