【摘要】：本論文共四章,第一章論述了米團花(Leucosceptrum canum)二萜/二倍半萜合酶初步催化機制的研究;第二章闡述了“六合一”(LHY)工程大腸桿菌代謝物及抗細菌活性的研究;第三章闡述了竹黃菌(Shiraia bambusicola)和竹紅菌(Hpocrellabambusae)化學成分和生物活性的比較研究;第四章綜述了竹紅菌的化學成分、生物活性以及竹紅菌素的給藥研究進展。第一章米團花萜類合酶初步催化機制研究二倍半萜(sesterterpenoids)是五個異戊二烯結(jié)構(gòu)單元構(gòu)成分子骨架的一類天然產(chǎn)物,由二倍半萜合酶催化香葉基法尼基焦磷酸酯(geranylfarnesyl diphosphate,GFPP)衍生而來。前期實驗室從米團花腺毛中克隆并功能鑒定了一個雙功能二萜/二倍半萜合酶,但它的活性中心以及如何調(diào)控兩種萜類產(chǎn)物合成的機制尚未知曉。在此基礎上,本論文通過對LcTPS25進行定點突變,成功構(gòu)建了 11個突變酶,并對突變酶進行了體內(nèi)酶活實分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)7個突變酶(LcTPS25-277Y/W,-277Y/A,-415I/S,-429W/G,-447T/A,-505N/A和-509V/F)的二倍半萜和二萜合酶活性均顯著降低,其中突變酶LcTPS25-277Y/w完全失去活性;突變酶LcTPS25-411L/A的活性變化小,LcTPS25-516F/A的二倍半萜合酶活性顯著增強,而LcTPS25-419M/G和-512R/A的二倍半萜合酶活性有一定的增強。另外,本論文研究了LcTPS25在植物體內(nèi)的功能。構(gòu)建了LcTPS25和GFPPS瞬時表達載體,并通過農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化方法實現(xiàn)目的基因在煙草中的瞬時表達。結(jié)果顯示LcTPS25在煙草瞬時表達體系的酶活產(chǎn)物與其在大腸桿菌表達體系的產(chǎn)物一致,表明LcTPS25的功能可能不受表達宿主的影響。本論文揭示了LcTPS25的初步催化機制,為深入研究植物二倍半萜合酶的催化機制奠定了基礎,同時也為二倍半萜化合物的生物合成及代謝工程改造提供了科學依據(jù)。第二章“六合一”工程大腸桿菌代謝物與抗細菌活性研究線蟲(nematode)是一類病原微生物,植物寄生線蟲對全球農(nóng)作物造成重大危害。課題組前期發(fā)現(xiàn),細菌型聚酮合酶-非核糖體肽合酶(PKS-NRPS)雜合生源次級代謝產(chǎn)物thermolides有顯著毒殺線蟲活性,并構(gòu)建了 1株高溫菌PKS-NRPS基因簇、谷胱甘肽硫-轉(zhuǎn)移酶、細胞色素P450酶、轉(zhuǎn)運蛋白、水解酶和烯酰還原酶在大腸桿菌BL21中共表達的菌株“六合一”(Lhy)。本論文利用多種柱層析對該工程大腸桿菌發(fā)酵液的乙酸乙酯萃取浸膏進行了化學成分的分離與純化,從中分離鑒定了 15個化合物,包括7個氯霉素的�；〈苌�(glhy9～glhy15)。測試glhy10～glhy15的抗細菌活性,發(fā)現(xiàn)其活性均比氯霉素低,表明細菌可以通過�；饔脤⒙让顾刈兂啥拘暂^低的氯霉素衍生物,為細菌抵抗氯霉素的作用機制研究奠定了基礎。第三章竹黃菌和竹紅菌化學成分及細胞毒活性的比較研究竹黃菌和竹紅菌是我國民間用于治療胃病和風濕性關節(jié)炎的傳統(tǒng)中藥,但它們的區(qū)別少有報道。為研究二者的差異,本論文對兩種真菌子座的甲醇提取物進行了跟蹤分離,從竹黃菌和竹紅菌中分別分離鑒定了 14個和8個化合物,兩者相同的成分為竹紅菌甲素(gSb1)、竹紅菌乙素(gSb2)、竹紅菌丙素(gSb3)、過氧麥角甾醇(gHb6)、3,6,8-三羥基-1-甲基口山酮(gHb7)和3,8-二羥基-6-甲氧基-1-甲基口山酮(gHb8),其中gSb1～gSb3是兩種真菌主要的相同成分;二者主要差異成分為11,11'-二去氧沃替西林(gSb4)和灰黃霉素(gHb5)。首次從竹黃菌中分離到麥角甾-7,22E-二烯-3β,5α,6β-三醇(gSb8)和麥角甾-7,22E-二烯-2β,3α,9α-三醇(gSb10),并首次從竹紅菌中分離到竹紅菌丁素(gHb4)、gHb5、gHb7和gHb8�；钚院Y選發(fā)現(xiàn),gSb4對人肺腺癌細胞、人肝癌細胞和人乳腺癌細胞有很強細胞毒活性,gSb1活性較強,而gHb4活性微弱,表明竹黃菌可能比竹紅菌更具有抗腫瘤應用前景,為二者的開發(fā)利用提供了參考價值。第四章竹紅菌的研究進展本章綜述了截止2019年3月國內(nèi)外報道的竹紅菌的化學成分、生物活性和竹紅菌素的給要研究。
【圖文】：

圖１．２篩選的氨基酸殘基的位點和結(jié)構(gòu)逡逑Ｆｉｇ邋１．２邋Ｓｉｔｅ邋ａｎｄ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ｓｃｒｅｅｎｅｄ邋ａｍｉｎｏ邋ａｃｉｄ邋ｒｅｓｉｄｕｅｓ逡逑

圖１．３Ｂ）突逡逑變酶對酶活產(chǎn)物的影響較小，揭示了邋４１１位亮氨酸突變成Ｒ基更小的丙氨酸后對逡逑ＬｃＴＰＳ２５活性的影響較其它突變酶小
【學位授予單位】：云南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R284

【參考文獻】

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本文編號：2590853