發(fā)布時間：2020-10-27 15:24

　　 背景與目的:當(dāng)今社會,飲酒造成的社會問題不斷增多,給社會管理帶來了極大的壓力。許多民事和刑事案件都是由于當(dāng)事人飲酒過度或者不適時地飲酒引發(fā)的,不僅給當(dāng)事人自身和其家庭帶來了傷害,也影響到社會的穩(wěn)定。在法醫(yī)學(xué)鑒定中,圍繞乙醇在傷害或死亡結(jié)果中的作用、法律責(zé)任的認(rèn)定等問題容易成為爭論的焦點,如何診斷及鑒定也是實踐工作中急需解決的難題。因此,做好乙醇對機(jī)體相關(guān)作用的研究有著重要的意義,它可以從理論上為解決法醫(yī)學(xué)鑒定工作難題提供基礎(chǔ)。海馬組織是大腦邊緣系統(tǒng)的重要組成部分,它一方面具有記憶以及空間定位的作用,另一方面也參與感知覺信息處理、情緒和運動等多種高級神經(jīng)活動。乙醇作用可能導(dǎo)致海馬神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)異常,影響其正常的生理功能,導(dǎo)致記憶、學(xué)習(xí)和行為障礙。目前為止,有關(guān)乙醇對神經(jīng)細(xì)胞胞體和突起的結(jié)構(gòu)影響、形貌改變等研究較少。本研究利用原子力顯微鏡高分辨率成像技術(shù)對細(xì)胞生物學(xué)研究的獨特優(yōu)點,觀察體外培養(yǎng)的大鼠原代海馬神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)特征,并研究不同濃度乙醇作用不同時間對細(xì)胞形態(tài)的影響,進(jìn)一步探究海馬神經(jīng)細(xì)胞的表面結(jié)構(gòu)以及乙醇對神經(jīng)細(xì)胞的損傷機(jī)制。方法:對出生24h內(nèi)的SD大鼠乳鼠進(jìn)行腦部解剖,分離出大腦海馬組織,通過胰酶消化、玻璃管吹打的方式使海馬神經(jīng)細(xì)胞分散,然后離心收集細(xì)胞進(jìn)行體外原代培養(yǎng)。分別在細(xì)胞生長第1、4、7天取海馬神經(jīng)細(xì)胞并標(biāo)記,4%多聚甲醛固定,用原子力顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)特征和變化,并對相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行收集整理。取第7天培養(yǎng)的狀況良好的海馬神經(jīng)細(xì)胞隨機(jī)分成四組,分別為對照組,乙醇低濃度組、中濃度組和高濃度組。在乙醇低、中、高濃度組的培養(yǎng)液中加入適量無水乙醇,使乙醇的終濃度分別為0.5g/L、1.5g/L、3.0g/L。對照組在培養(yǎng)液中加入等量的滅菌PBS溶液。將四個濃度組的細(xì)胞再按不同的乙醇作用時間隨機(jī)分組,依次培養(yǎng)1h、4h、8h、12h,然后使用4%多聚甲醛固定細(xì)胞,原子力顯微鏡進(jìn)行形態(tài)觀察,收集圖像數(shù)據(jù)做統(tǒng)計分析。結(jié)果:1.在原子力顯微鏡下,培養(yǎng)第1天的海馬神經(jīng)細(xì)胞由原先的圓形或橢圓形逐漸生長為梭形或三角形,胞體上伸出細(xì)胞突起。培養(yǎng)第4天,海馬神經(jīng)細(xì)胞突起進(jìn)一步延長并分支,細(xì)胞的突起相互接觸,初步形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。此階段,海馬神經(jīng)細(xì)胞胞體表面可看到近似圓形的“孔洞”。培養(yǎng)至第7天,海馬神經(jīng)細(xì)胞基本成熟,細(xì)胞胞體飽滿,輪廓清楚。胞體表面的孔洞直徑為1.60μm左右,深度為80~170nm。細(xì)胞突起伸長,長度可達(dá)胞體的2~3倍。2.乙醇對海馬神經(jīng)細(xì)胞的形貌有影響,不同濃度乙醇造成的胞體高度和面粗糙度的改變有差別。低濃度乙醇作用1h、4h、8h時細(xì)胞形貌基本與對照組一致,作用12h時神經(jīng)細(xì)胞胞體高度下降,面粗糙度減小。中濃度乙醇作用時,細(xì)胞突起發(fā)生凹陷,完整性被破壞,細(xì)胞胞體有部分塌陷,胞體高度下降,面粗糙度減小。高濃度乙醇作用時,細(xì)胞胞體高度下降,面粗糙度減小,中部塌陷嚴(yán)重,細(xì)胞輪廓消失,胞體形狀不規(guī)則。結(jié)論:1.海馬神經(jīng)細(xì)胞在生長過程中,胞體表面出現(xiàn)近似圓形的孔洞,孔徑為1~2μm,深度80~170nm。2.中、高濃度的乙醇對海馬神經(jīng)細(xì)胞的形貌有影響,可導(dǎo)致胞體高度下降和面粗糙度減小;神經(jīng)細(xì)胞的胞體和突起的結(jié)構(gòu)被破壞,發(fā)生局部塌陷和結(jié)構(gòu)缺失。
【學(xué)位單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：D919
【部分圖文】：

果正常海馬神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)觀察 倒置顯微鏡下觀察養(yǎng)至第 7 天的海馬神經(jīng)細(xì)胞經(jīng) NSE 免疫細(xì)胞化學(xué)法染色后，陽性漿和細(xì)胞突起呈棕色，胞核呈藍(lán)色。陰性對照組中細(xì)胞胞漿和胞隨機(jī)選取 10 個視野，用軟件 Image-Pro Plus 6.0 計算每個視野的陽胞總數(shù)的百分比。10 個視野中平均陽性細(xì)胞率約為 95%，即原代神經(jīng)細(xì)胞的純度為 95%。

圖 3.2 原子力顯微鏡下正常生長海馬神經(jīng)細(xì)胞的形貌（A 和 B：細(xì)胞生長 1 天； C：細(xì)胞生長 4 天； D：細(xì)胞生長 7 天）圖 3.3 正常生長海馬神經(jīng)細(xì)胞上的孔洞（A：細(xì)胞生長 4 天； B：細(xì)胞生長 7 天）

正常生長海馬神經(jīng)細(xì)胞上的孔洞
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2858700