發(fā)布時(shí)間：2019-02-21 17:42

【摘要】：隨著年輕腫瘤患者的發(fā)病率和治愈率的不斷提高,以及放化療所帶來(lái)的不同程度的生育功能損害,年輕腫瘤病人保護(hù)和保留生育功能的訴求越來(lái)越迫切。作為增殖分化極度活躍的器官,睪丸是輻射和化療藥物的敏感靶標(biāo)之一。開(kāi)發(fā)一種用于防治放化療所致雄性生殖系統(tǒng)損傷的藥物能夠?yàn)榛颊咛峁└�高的生活質(zhì)量。TLR5配體鞭毛蛋白衍生物CBLB502通過(guò)TLR5依賴(lài)途徑激活NF-κB信號(hào)通路,有效地減輕電離輻射引起的造血細(xì)胞、腸道上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡,并促進(jìn)再生,是目前最有潛在價(jià)值的輻射防護(hù)藥物之一。CBLB502對(duì)多種實(shí)體腫瘤,肝毒性物質(zhì)以及化療藥物引起的組織和器官損傷有廣泛的抑制作用。本文對(duì)CBLB502對(duì)輻射所致小鼠生殖系統(tǒng)的保護(hù)作用及機(jī)制進(jìn)行了探究,并為CBLB502用于臨床上白血病的聯(lián)合治療提供了依據(jù)。第一部分:將160只C57BL/6J小鼠,隨機(jī)分為四組:正常對(duì)照組(假照射,Sham)、CBLB502單獨(dú)給藥組(502)、5 Gyγ射線照射組(5 Gy)和CBLB502預(yù)處理組(5 Gy+502);CBLB502預(yù)處理組在照射前30 min注射20 mg/kg CBLB502。在照射后第1天、3天、7天、15天、30天、60天和120天觀察小鼠的各項(xiàng)生殖指標(biāo)。用SCA精子圖像分析系統(tǒng)分析附睪中精子總數(shù)和活動(dòng)度,伊紅染色分析精子的畸形率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)輻照后30天CBLB502預(yù)處理組明顯改善輻射引起的精子總數(shù)減少(p0.05)和活動(dòng)度下降(p0.05),降低精子畸形率(p0.001)。睪丸臟器指數(shù)顯示CBLB502可以減輕睪丸體積和重量的萎縮(p0.05)。睪丸組織HE染色結(jié)果顯示輻射后睪丸病理?yè)p傷從第1天到第60天持續(xù)加重,生精小管排列完全紊亂,腔內(nèi)精子消失殆盡,僅殘留支持細(xì)胞和少量精原細(xì)胞。CBLB502預(yù)處理組的損傷程度明顯減輕,第7天才可見(jiàn)腔內(nèi)精子數(shù)量減少,第30天,生精上皮厚薄不均,排列疏松,之后便開(kāi)始恢復(fù)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)睪丸內(nèi)單倍體細(xì)胞比例,CBLB502預(yù)處理組明顯高于輻射對(duì)照組(53.49±2.46%vs 34.99±2.23%;p0.001)。輻照后70天(約2個(gè)小鼠生精周期)將雄性小鼠與雌鼠按照1:2的比例合籠配對(duì),2周后CBLB502預(yù)處理與輻照組相比,雌鼠的受孕率40.0%提高到73.3%,窩仔數(shù)由4.18±1.23只/窩增加到6.13±1.41只/窩。以上結(jié)果表明,CBLB502可以提高精子的活動(dòng)度和精子數(shù)量,減少精子畸形,保護(hù)睪丸組織結(jié)構(gòu)完整,提高小鼠的生育能力。TUNEL檢測(cè)輻照后12 h睪丸細(xì)胞凋亡,結(jié)果顯示CBLB502預(yù)處理組小鼠每個(gè)生精小管內(nèi)平均TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著低于輻射對(duì)照組(4.80±0.80 vs 8.69±0.93,p0.05),表明CBLB502能減少細(xì)胞凋亡。彗星電泳方法檢測(cè)睪丸細(xì)胞內(nèi)DNA損傷,通過(guò)分析慧尾DNA比例,發(fā)現(xiàn)CBLB502可明顯減輕輻射所致DNA損傷(p0.01)。骨髓細(xì)胞染色體畸形率試驗(yàn)顯示,CBLB502預(yù)處理組畸形率低于輻射對(duì)照組(p0.05),而且其后代染色體畸形率也明顯低于輻照組后代(p0.05),接近正常對(duì)照組比例。以上表明CBLB502預(yù)處理可以減輕DNA損傷,降低染色體畸形,減少細(xì)胞凋亡,降低遺傳毒性。試劑盒檢測(cè)輻照后4 h睪丸組織內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的含量。結(jié)果顯示,CBLB502預(yù)處理顯著增加睪丸組織中SOD的含量,及時(shí)清除電離產(chǎn)生的超氧自由基,降低脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物MDA的含量,有效緩解ROS對(duì)生物膜的過(guò)氧化損傷。ELISA方法檢測(cè)血清中睪酮(T)、黃體生成素(LH)和促卵泡激素(FSH)含量。CBLB502預(yù)處理的睪酮水平是輻照對(duì)照組的2倍(p0.05),LH和FSH兩組之間沒(méi)有顯著差異。Real-time PCR結(jié)果顯示,相比于輻射對(duì)照組,CBLB502上調(diào)抑制素B(INH B)mRNA的表達(dá),而雄激素結(jié)合蛋白(ABP)沒(méi)有明顯差異。睪酮主要由間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生分泌的,抑制素B是支持細(xì)胞的產(chǎn)物,表明CBLB502可以協(xié)助維持睪丸結(jié)構(gòu)完整和內(nèi)分泌環(huán)境的穩(wěn)定。CBLB502預(yù)處理的Tlr5基因缺失小鼠其對(duì)生殖系統(tǒng)的輻射保護(hù)效果明顯低于CBLB502預(yù)處理野生型的小鼠。直接證明CBLB502主要通過(guò)TLR5信號(hào)通路保護(hù)睪丸組織免受輻射損傷。利用Real-time PCR、Western blot和免疫組化的方法主要分析了NF-κB和p53相關(guān)信號(hào)通路。結(jié)果表明電離輻射激活p53,引起下游p21、Bax(促凋亡蛋白)和Caspase-3的表達(dá)上調(diào),繼而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡;而CBLB502預(yù)處理可以明顯下調(diào)這些基因和蛋白表達(dá)。CBLB502預(yù)處理小鼠顯著增強(qiáng)p65磷酸化,激活NF-κB信號(hào)通路,上調(diào)Bcl-2(抑凋亡蛋白)的表達(dá)。相比于輻射對(duì)照組,CBLB502明顯上調(diào)增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的表達(dá),參與細(xì)胞DNA的損傷修復(fù)。第二部分:文獻(xiàn)提示CBLB502對(duì)造血系統(tǒng)具有輻射防護(hù)作用,那么CBLB502在保護(hù)骨髓造血細(xì)胞的同時(shí),是否會(huì)保護(hù)白血病細(xì)胞或影響白血病的治療的研究顯得十分重要。為此我們利用人紅白血病K562細(xì)胞進(jìn)行了探討。首先C57BL/6J小鼠在6.5 Gyγ射線全身照射前30 min,腹腔分別注射CBLB502、PBS、氨磷汀(WR2721),觀察骨髓造血祖細(xì)胞集落形成情況。結(jié)果顯示CBLB502預(yù)處理組BFU-E(爆式紅系集落形成單位)、CFU-MK(巨核細(xì)胞集落形成單位)和CFU-GM(粒細(xì)胞-單核細(xì)胞集落生成單位)的數(shù)目均明顯好于PBS和氨磷汀。CBLB502能刺激各系造血祖細(xì)胞向成熟造血細(xì)胞分化,促進(jìn)造血恢復(fù)。流式細(xì)胞術(shù)和免疫印跡結(jié)果顯示K562細(xì)胞表達(dá)TLR5;MTT法測(cè)K562細(xì)胞增殖,不同濃度的CBLB502對(duì)K562細(xì)胞的增殖沒(méi)有明顯影響;在10 Gyγ射線照射和化療藥物阿糖胞苷對(duì)K562細(xì)胞處理前加入CBLB502(終濃度為200 ng/ml),結(jié)果表明CBLB502不影響γ射線照射及阿糖胞苷對(duì)K562細(xì)胞的殺傷效果。裸鼠皮下接種K562細(xì)胞后,腫瘤周?chē)�注射CBLB502或PBS,連續(xù)14天測(cè)量腫瘤體積和重量。CBLB502從注射后第6天起腫瘤體積明顯小于PBS組(p0.05);CBLB502注射后第14天腫瘤重量顯著小于PBS組(175.83±17.32 mg vs 273.52±24.08 mg,p0.01)。我們進(jìn)行了骨髓移植-重建試驗(yàn)。在CD45.2+小鼠進(jìn)行8.5Gy全身照射,清髓前腹腔注射CBLB502。清髓后12小時(shí)尾靜脈注射CD45.1+小鼠骨髓細(xì)胞,一個(gè)月后流式檢查骨髓細(xì)胞重建率,CBLB502與正常對(duì)照組之間沒(méi)有顯著差異。表明CBLB502對(duì)骨髓移植無(wú)影響。綜上所述,CBLB502能明顯提高輻照后精子的數(shù)量和活動(dòng)度,減少精子畸形,保護(hù)睪丸組織結(jié)構(gòu)完整,提高小鼠的生育能力,降低遺傳毒性。CBLB502增強(qiáng)抗氧化酶SOD活性,降低MDA,上調(diào)PCNA,促進(jìn)DNA損傷修復(fù)。這種保護(hù)作用主要通過(guò)TLR5依賴(lài)途徑激活NF-κB通路減輕炎癥并抑制p53依賴(lài)性凋亡,下調(diào)Bax,上調(diào)Bcl-2。在白血病治療應(yīng)用上,CBLB502特異性保護(hù)骨髓造血系統(tǒng)促進(jìn)細(xì)胞分化,但不保護(hù)白血病細(xì)胞,不影響白血病細(xì)胞放化療敏感性、不影響骨髓移植,并抑制K562細(xì)胞在體內(nèi)生長(zhǎng)。
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【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R818

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 孫巧平;鐘進(jìn)義;李蕾;崔靜;;萘乙酸誘發(fā)小鼠睪丸生精細(xì)胞損傷作用的研究(英文)[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2010年03期

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本文編號(hào)：2427737