發(fā)布時間：2020-11-11 17:31

　　 本研究主要由以下三部分組成:第一部分發(fā)育期氟暴露損傷子代大鼠學習和記憶能力及其潛在機制的探討目的:由于氟能穿過胎盤和血腦屏障在腦組織中蓄積,氟致神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育毒性已經(jīng)引起廣泛的關注。有研究表明細胞凋亡在氟致神經(jīng)毒性中發(fā)揮重要作用,但作為一條介導細胞凋亡的重要通路,p53介導的細胞凋亡途徑是否參與其中尚不清楚。本研究旨在探討氟化鈉(sodium fluoride,NaF)發(fā)育期暴露對子代大鼠學習和記憶能力的影響及其潛在機制。方法:將30只清潔級成年SD(Sprague-Dawley)大鼠(雌雄各半)按性別隨機分為對照組及氟暴露組(低劑量組和高劑量組),每組雌雄各5只。其中低劑量和高劑量氟暴露組分別給予含10 mg/L和50 mg/L NaF飲水,而對照組則給予飲用自來水(氟化物﹤1 mg/L)。兩個月之后,將各組中的雌雄大鼠隨機合籠(1:1)交配,成功受孕后的雌鼠分開單籠飼養(yǎng),并繼續(xù)給予相同的飲水條件,直至子代大鼠斷奶。然后將斷奶后的子代大鼠按照性別和分組給予與親代相同飲水條件分籠飼養(yǎng),直至子代大鼠出生后2個月。染毒結(jié)束后,每組隨機挑選6只雌性子代大鼠并做好標記,采用Morris水迷宮實驗評估子代大鼠學習和記憶能力,Western blot檢測子代大鼠海馬組織中SIRT1、p53(acetyl K379)和p53凋亡通路相關蛋白如p53、PUMA和cytochrome c(cyto c)的表達水平。結(jié)果:Morris水迷宮的實驗結(jié)果表明,在定位航行實驗(place navigation test,PNT)中,與同時間點的對照組相比,50 mg/L的NaF染毒劑量組子代大鼠在第三天和第四天逃避潛伏期顯著長于對照組,且對照組與氟染毒組子代大鼠逃避潛伏期均隨時間呈下降的趨勢,50 mg/L的NaF染毒組逃避潛伏期顯著長于對照組;在空間探索實驗(spatial probe test,SPT)中,與對照組相比,50 mg/L的NaF染毒組子代大鼠穿環(huán)次數(shù)、目標象限的路程百分比和時間百分比均顯著降低。以上結(jié)果表明,暴露50 mg/L的NaF可以損傷子代大鼠的學習和記憶能力。同時,Western blot結(jié)果顯示,50mg/L的NaF可顯著上調(diào)子代大鼠海馬組織中p53、cleaved caspase-3、PUMA、cyto c、p53(acetyl K379)和SIRT1的蛋白表達水平。結(jié)論:氟的發(fā)育期暴露可顯著損傷子代大鼠的學習和記憶能力,且激活其海馬組織中p53介導的細胞凋亡通路,表明p53凋亡通路介導的細胞凋亡可能參與調(diào)控氟致子代大鼠的神經(jīng)發(fā)育毒性,且SIRT1可能作為上游信號分子參與調(diào)控。第二部分氟化鈉通過激活p53介導的線粒體凋亡通路誘導SH-SY5Y細胞凋亡目的:研究NaF是否誘導人神經(jīng)母細胞瘤細胞(SH-SY5Y)發(fā)生細胞凋亡及p53介導的細胞凋亡通路在該過程中的作用,進一步闡明氟致神經(jīng)毒性的分子機制。方法:首先通過CCK-8實驗確定NaF染毒SH-SY5Y細胞的濃度。采用20mg/L、40 mg/L和60 mg/L的NaF染毒SH-SY5Y細胞24 h后,采用Hoechst33342染色觀察細胞核的形態(tài)學改變和Annexin V–FITC/propidium iodide雙染后流式細胞術檢測SH-SY5Y細胞的凋亡率;采用Western blot檢測p53和p53線粒體凋亡相關蛋白(包括PUMA、Bax、Bcl-2、cyto c、cleaved caspase-3和cleaved PARP)的表達水平;采用免疫熒光檢測p53和Bax的線粒體轉(zhuǎn)位以及cyto c的線粒體釋放情況;采用p53轉(zhuǎn)錄活性抑制劑pifithrin-α預處理細胞1 h,接著采用60mg/L NaF處理細胞24 h后流式細胞術檢測細胞的凋亡率和Western blot檢測凋亡相關蛋白的表達水平。結(jié)果:CCK-8實驗結(jié)果顯示,與對照組相比,當NaF濃度為40 mg/L、50mg/L、60 mg/L和80 mg/L時,細胞活力顯著降低(分別為84.84%,70.76%,52.31%和34.31%),故選擇20 mg/L、40 mg/L和60 mg/L為NaF處理SH-SY5Y細胞的濃度。當采用20 mg/L、40 mg/L和60 mg/L的NaF處理SH-SY5Y細胞24h后,Hoechst 33342染色后顯示細胞核碎裂和濃染、流式細胞術顯示升高的細胞凋亡率和cleaved caspase-3和cleaved PARP的表達水平上調(diào)均表明40 mg/L和60mg/L的NaF處理SH-SY5Y細胞24 h后可以誘導細胞發(fā)生凋亡。SH-SY5Y細胞暴露于60 mg/L的NaF 24 h后,p53及p53細胞凋亡通路相關蛋白PUMA和cyto c的表達水平顯著增加,而Bcl-2的表達水平顯著下降;同時,在SH-SY5Y細胞中,40 mg/L和60 mg/L的NaF可顯著促進p53發(fā)生核轉(zhuǎn)位,20 mg/L、40 mg/L和60 mg/L的NaF可顯著促進Bax發(fā)生線粒體轉(zhuǎn)位,而60 mg/L的NaF可以顯著促進cyto c由線粒體釋放至胞漿。采用p53轉(zhuǎn)錄活性抑制劑pifithrin-α干預可顯著降低NaF誘導的細胞凋亡率和凋亡相關蛋白的表達水平的增加。結(jié)論:一定濃度的NaF可以通過激活p53線粒體凋亡通路來誘導SH-SY5Y細胞凋亡,且p53線粒體通路依賴于p53的轉(zhuǎn)錄活性。因此,p53可能為預防和治療氟誘導的神經(jīng)毒性提供了一個潛在的靶標。第三部分SIRT1過表達和白藜蘆醇可通過抑制p53乙酰化緩解氟化鈉誘導的SH-SY5Y細胞凋亡目的:研究在誘導SH-SY5Y細胞凋亡的過程中,NaF對p53去乙�；�酶SIRT1的影響及SIRT1在該過程中的作用。方法:采用20 mg/L、40 mg/L和60 mg/L的NaF處理SH-SY5Y細胞24 h后利用SIRT1去乙�；�酶試劑盒檢測SIRT1去乙酰化酶活性和Western blot檢測p53(acetyl K382)和SIRT1蛋白表達水平;采用腺病毒過表達SIRT1 24 h,接著采用60 mg/L的NaF處理細胞24 h后,流式細胞術檢測細胞凋亡率和Western blot檢測蛋白cleaved PARP、cleaved caspase-3、p53(acetyl K382)和p53的表達水平;采用60 mg/L的NaF處理細胞24 h前先用SIRT1激動劑白藜蘆醇(resveratrol,RSV)預處理SH-SY5Y細胞2 h,染毒結(jié)束后采用Western blot檢測蛋白cleaved PARP、cleaved caspase-3、p53(acetyl K382)和p53的表達水平。結(jié)果:60 mg/L的NaF可顯著抑制SH-SY5Y細胞SIRT1去乙�；�酶活性,40mg/L和60 mg/L的NaF顯著上調(diào)SIRT1和p53(acetyl K382)的表達水平;在SHSY5Y細胞中采用腺病毒過表達SIRT1能夠顯著改善NaF誘導的細胞凋亡和cleaved caspase-3、cleaved PARP和p53(acetyl K382)的上調(diào)表達情況;采用RSV干預SH-SY5Y細胞后能顯著下調(diào)NaF誘導的cleaved caspase-3、cleaved PARP、p53(acetyl K382)和p53的蛋白水平。結(jié)論:NaF可通過抑制SIRT1去乙�；�酶活性上調(diào)p53(acetyl K382)水平,從而激活p53介導的線粒體凋亡通路誘導SHSY5Y細胞發(fā)生凋亡,且過表達SIRT1或者RSV干預均能部分逆轉(zhuǎn)其誘導的細胞凋亡,表明SIRT1可作為p53的上游信號調(diào)控分子,參與調(diào)控NaF誘導SH-SY5Y細胞凋亡。因此,SIRT1可能為預防和治療氟誘導的神經(jīng)毒性提供是一個潛在的靶標和新思路。
【學位單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R114
【部分圖文】：

華 中 科 技 大 學 博 士 學 位 論 文育期暴露對子代大鼠一般情況的影響各組雌鼠均能成功受孕，孕鼠一般情況良好，均無表然分娩，每窩仔鼠至少為 8只，對照組和 10 mg/L的 /L的 NaF 組偶見 1-2次死胎。各組子代大鼠生長發(fā)育和水量也均無異常。子代雌性大鼠體重均有增長，但各1-1，P > 0.05）。同時，如表 1-11所示，50 mg/L的 N臟和卵巢臟器系數(shù)顯著小于對照組（P < 0.05），而甲對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。

華 中 科 技 大 學 博 士 學 位 論 文且自身沒有暴露于 NaF 的雌性子代大鼠為對照組。分析 MWM 實驗結(jié)果表明，如圖 1-2 所示，在 PNT 中，與同時間點的對照組相比，50 mg/L 的 NaF 染毒劑量組子代大鼠在第三天和第四天逃避潛伏期顯著長于對照組（P < 0.05，圖 1-2A），且對照組與氟染毒組子代大鼠逃避潛伏期均隨時間呈下降的趨勢，50 mg/L 的NaF 染毒組逃避潛伏期顯著長于對照組（P < 0.05，圖 1-2A）；在 SPT 中，與對照組相比，50 mg/L 的 NaF 染毒組子代大鼠穿環(huán)次數(shù)、目標象限的路程百分比和時間百分比均顯著降低（P < 0.05，圖 1-2C-E）。以上結(jié)果表明，暴露 50 mg/L的 NaF可以損傷子代大鼠的學習和記憶能力。

華 中 科 技 大 學 博 士 學 位 論 文2.3 氟的發(fā)育期暴露激活子代大鼠海馬組織 p53 凋亡通路本研究接下來研究氟的發(fā)育期暴露能否激活子代大鼠海馬組織 p53 凋亡通路。MWM 實驗結(jié)束后，將子代大鼠頸椎脫臼處死后立即取出海馬組織。采用Western blot 檢測 p53 凋亡通路相關蛋白的表達水平。結(jié)果如圖 1-3 所示，與對照組相比，50 mg/L 的 NaF 可顯著上調(diào)子代大鼠海馬組織中的 p53、cyto c、PUMA和 cleaved caspase-3的蛋白表達水平（P < 0.05）。以上結(jié)果表明，氟的發(fā)育期暴露可激活子代大鼠海馬組織 p53 凋亡通路，且細胞凋亡可能參與調(diào)控氟致子代大鼠學習和記憶能力損傷。
【參考文獻】

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1 孫殿軍,王麗華,姜樹林,陳志,魏紅聯(lián),沈雁峰;中國大陸地方性砷中毒病情與防治動態(tài)、現(xiàn)狀的分析[J];中國地方病防治雜志;2002年02期

本文編號：2879511