發(fā)布時(shí)間：2020-11-05 07:19

　　 背景和目的大量研究表明矽肺病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程與機(jī)體免疫功能的變化密切相關(guān),包括非特異性免疫、體液免疫、細(xì)胞免疫等均發(fā)揮了重要作用。矽塵是一種半抗原,可有選擇地吸附體內(nèi)物質(zhì)組成復(fù)合抗原,巨噬細(xì)胞損傷或凋亡釋放的脂蛋白等可成為自身抗原,因此塵肺的肺組織具有復(fù)雜的抗原成分。國(guó)內(nèi)外學(xué)者均觀察到矽肺病患者機(jī)體體液免疫功能明顯增強(qiáng),而矽肺患者細(xì)胞免疫功能大多降低。以往研究表明,接塵工人、矽肺患者體內(nèi)存在病理情況下才出現(xiàn)的的抗體即自身抗體,但由于技術(shù)限制,僅對(duì)某一或某些抗體進(jìn)行了檢測(cè),對(duì)某些期別、某個(gè)階段的抗體進(jìn)行了探討,尚缺乏對(duì)矽肺病免疫抗體改變的全譜、全程、系統(tǒng)的觀察研究。隨著近年來(lái)細(xì)胞免疫學(xué)、分子免疫學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展,抗體庫(kù)技術(shù)越來(lái)越成熟,為探討矽肺免疫抗體在塵肺的發(fā)生發(fā)展中的作用提供了新的途徑和方法。噬菌體展示技術(shù)是以噬菌體外殼蛋白PⅢ或PⅧ基因?yàn)檩d體,在噬菌體中插入一段需要表達(dá)的基因片段,該外源基因片段可以在噬菌體表面PⅢ或PⅧ蛋白N末端形成一定的空間構(gòu)象表達(dá)相應(yīng)的蛋白。利用隨機(jī)短肽與絲狀噬菌體的表面蛋白PⅢ融合,并展示在噬菌體表面,首次建立了噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)以來(lái),噬菌體展示技術(shù)運(yùn)用已經(jīng)相當(dāng)成熟,關(guān)于人源塵肺病噬菌體單鏈抗體庫(kù)構(gòu)建課題組前期已經(jīng)成功構(gòu)建,篩選出了幾種煤工塵肺相關(guān)抗原抗體,并驗(yàn)證了其在接塵工人和煤工塵肺病患者血液中的表達(dá),考慮到煤工塵肺患者接觸的為混合性粉塵,且人群免疫反應(yīng)較為復(fù)雜,影響因素較多,采用單一性二氧化硅粉塵構(gòu)建大鼠矽肺模型,建立相對(duì)較為特異的矽肺噬菌體單鏈抗體庫(kù)并從中篩選出矽肺相關(guān)抗體具有重要意義。方法1.構(gòu)建大鼠矽肺模型:對(duì)大鼠進(jìn)行二氧化硅懸液肺灌注,采用非氣管暴露法經(jīng)口間斷注入二氧化硅懸液1ml(含SiO2100mg),注意觀察其活動(dòng)狀態(tài),灌注完成后輕撫大鼠胸部使粉塵分散至全肺,并使大鼠盡快解除窒息,以相同方法灌注1ml生理鹽水作為對(duì)照組。分別在3、6、9、12周每個(gè)時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各處死6只,取組織樣本和外周血備用。2.擴(kuò)增單鏈抗體基因:提取矽肺模型構(gòu)建成功的大鼠外周血,用大鼠外周血淋巴細(xì)胞分離液提取淋巴細(xì)胞,triozl法提取單核細(xì)胞總rna,用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cdna。采用兼并引物經(jīng)pcr擴(kuò)增抗體輕重鏈可變區(qū)基因,使用帶有粘端的linker將輕重鏈可變區(qū)連接成單鏈抗體。3.構(gòu)建噬菌體單鏈抗體庫(kù):將單鏈抗體和噬菌粒載體pcantab-5e進(jìn)行雙酶切后進(jìn)行拼接,然后轉(zhuǎn)染感受態(tài)大腸桿菌tg1,經(jīng)輔助噬菌體超感染,最終構(gòu)建成大鼠矽肺噬菌體單鏈抗體庫(kù)。4.對(duì)大鼠矽肺噬菌體單鏈抗體庫(kù)富集篩選:提取模型大鼠肺組織蛋白和對(duì)照組肺組織蛋白,對(duì)已構(gòu)建好的噬菌體單鏈抗體庫(kù)進(jìn)行4輪富集篩選,測(cè)定其庫(kù)容量。5.矽肺噬菌體單鏈抗體特異性檢測(cè):隨機(jī)選取最后一輪篩選后抗性平板上菌落20個(gè),提取質(zhì)粒包被在酶標(biāo)板中,elisa檢測(cè)矽肺大鼠(p)和對(duì)照組(n)肺組織蛋白o(hù)d450值,以p/n2.0為陽(yáng)性克隆。6.對(duì)陽(yáng)性克隆鑒定:將陽(yáng)性克隆質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果在ncbi網(wǎng)站中進(jìn)行blast比對(duì),然后將測(cè)序結(jié)果翻譯成蛋白質(zhì)氨基酸序列并對(duì)翻譯結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果1.利用噬菌體展示技術(shù)成功構(gòu)建了庫(kù)容量為7.2×109cfu/l的初級(jí)噬菌體單鏈抗體庫(kù)。2.以提取的矽肺模型肺組織蛋白為靶蛋白,利用噬菌體展示技術(shù),經(jīng)4輪富集篩選,成功篩選出具有較高親和力的抗矽肺大鼠的噬菌體單鏈抗體庫(kù),通過(guò)elisa方法,并經(jīng)核酸測(cè)序及blast比對(duì),從中篩選出3個(gè)大鼠矽肺模型相關(guān)抗體,分別是抗ifn-γ單鏈抗體,抗il-2r單鏈抗體和抗核糖體p蛋白單鏈抗體。結(jié)論利用噬菌體展示技術(shù)和基因工程技術(shù),構(gòu)建了庫(kù)容量為7.2×109cfu/L的初級(jí)矽肺大鼠噬菌體單鏈抗體庫(kù),通過(guò)篩選初步確定了3個(gè)特異性單鏈抗體并進(jìn)行了測(cè)序鑒定,分別是抗IFN-γ單鏈抗體,抗IL-2R單鏈抗體和抗核糖體P蛋白單鏈抗體。
【學(xué)位單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2016
【中圖分類】：R135.2
【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
中英文縮略詞表
1 前言
2 材料和方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        2.1.2 菌株與載體
        2.1.3 主要試劑
        2.1.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器
        2.1.5 主要試劑溶液配制
        2.1.6 PCR引物設(shè)計(jì)合成
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 矽肺大鼠模型構(gòu)建及外周血單核細(xì)胞RNA提取和cDNA文庫(kù)構(gòu)建
        2.2.2 PCR擴(kuò)增輕重鏈可變區(qū)基因
        2.2.3 Linker連接肽合成和酶促磷酸化粘端
        2.2.4 VH+Linker+VL（Sc Fv）制備
        2.2.5 合成重組質(zhì)粒與轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌TG1
        2.2.6 轉(zhuǎn)化后質(zhì)粒提取及特異性鑒定
        2.2.7 大鼠矽肺噬菌體單鏈抗體庫(kù)富集篩選
        2.2.8 Elisa法鑒定陽(yáng)性克隆
        2.2.9 陽(yáng)性克隆噬菌體提取及測(cè)序鑒定
3 結(jié)果
    3.1 矽肺模型大鼠外周血總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄結(jié)果
    3.2 抗體可變區(qū)擴(kuò)增結(jié)果
    3.3 單鏈抗體ScFv合成結(jié)果
    3.4 輔助噬菌體（M13K07）擴(kuò)增結(jié)果
    3.5 噬菌體抗體庫(kù)構(gòu)建結(jié)果及鑒定
    3.6 大鼠矽肺噬菌體單鏈抗體庫(kù)富集篩選結(jié)果
    3.7 陽(yáng)性克隆質(zhì)粒特異性檢測(cè)及測(cè)序鑒定結(jié)果
4 討論
    4.1 噬菌體抗體庫(kù)
    4.2 抗體庫(kù)的庫(kù)容量與多樣性
    4.3 篩選出的抗體與矽肺的關(guān)系
        4.3.1 抗IFN-γ 抗體與矽肺的關(guān)系
        4.3.2 抗IL-2R抗體與矽肺的關(guān)系
        4.3.3 抗核糖體P蛋白抗體與矽肺的關(guān)系
5 結(jié)論
6 參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
個(gè)人簡(jiǎn)歷
致謝

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