研究目的通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究BPA對(duì)其誘導(dǎo)的IR小鼠肝臟損傷,以及肝臟GSK3β相關(guān)蛋白活性的影響,并用GSK3β抑制劑下調(diào)GSK3β活性,探討GSK3β在BPA誘導(dǎo)IR小鼠肝臟炎性損傷中的調(diào)控作用,為制定環(huán)境中BPA暴露危害的防治措施和策略提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。研究方法SPF4周齡雄性C57BL/6J野生型小鼠72只,飼養(yǎng)于SPF級(jí)環(huán)境,自由進(jìn)食。將小鼠隨機(jī)分為NCD組、NCD+GSK3β抑制劑組、HFD組、HFD+GSK3β抑制劑組、HFD+1000 nmol/L BPA組、HFD+1000 nmol/L BPA+GSK3β抑制劑組,NCD代表正常飲食,HFD組代表高脂飲食,喂養(yǎng)8周和16周。BPA用DMSO(終濃度不超過1%)溶解,配成1000nmol/L的濃度,通過飲水?dāng)z入。GSK3β抑制劑在第6~8周和14~16周經(jīng)腹腔注射21.5mg/kg的GSK3β抑制劑Li Cl溶液,隔天1次,連續(xù)10天。每周記錄1次小鼠飲水量、飼料消耗量和體重。8周和16周時(shí),測(cè)定FG、檢測(cè)FI以及評(píng)定IR指數(shù);進(jìn)行ITT測(cè)試和GTT測(cè)試;每組分別麻醉頸椎脫臼處死小鼠6只,進(jìn)行眼球取血,檢測(cè)血清中AST、ALT的水平;計(jì)算肝臟系數(shù);采用HE法觀察小鼠肝臟組織病理學(xué)改變;采用IHC法檢測(cè)肝臟IL-1β、TNF-α、IL-6的表達(dá)水平;采用WB法檢測(cè)小鼠肝臟組織中GSK3β、p-GSK3β(Ser9)蛋白和胰島素通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平。結(jié)果1小鼠一般情況實(shí)驗(yàn)期間,各組小鼠一般狀態(tài)良好。不同時(shí)間點(diǎn),各組小鼠日平均飲水量和食物消耗量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 GSK3β抑制劑對(duì)BPA誘導(dǎo)小鼠體重和肝臟系數(shù)改變的影響2.1 BPA誘導(dǎo)小鼠體重及肝臟系數(shù)增加與NCD組相比,不同時(shí)間點(diǎn)HFD組小鼠體重均升高,從第10周起差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與HFD組相比,HFD+1000 nmol/L BPA組小鼠體重從第14周起增長(zhǎng)顯著,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與NCD組相比,8周和16周時(shí)HFD組小鼠肝臟系數(shù)顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與HFD組相比,HFD+1000 nmol/L BPA暴露組小鼠肝臟系數(shù)在16周時(shí)顯著上升,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.2 GSK3β抑制劑對(duì)BPA誘導(dǎo)小鼠體重和肝臟系數(shù)增加的影響與HFD組相比,HFD+GSK3β抑制劑組小鼠體重均下降,從第15周開始差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與HFD+1000 nmol/L BPA組相比,HFD+1000 nmol/L BPA+GSK3β抑制劑組小鼠體重在第7、8周及第15、16周時(shí)明顯下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與HFD+1000nmol/L BPA組相比,HFD+1000nmol/L BPA+GSK3β抑制劑組小鼠肝臟系數(shù)在16周時(shí)明顯下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3 GSK3β抑制劑對(duì)BPA誘導(dǎo)小鼠IR的影響3.1 BPA暴露對(duì)小鼠FG和FI及HOMA-IR的影響與NCD組相比,8周和16周時(shí)HFD組小鼠FG明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與HFD組相比,HFD+1000 nmol/L BPA組小鼠FG在16周時(shí)明顯升高,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與HFD組相比,8周和16周時(shí)HFD+1000 nmol/L BPA組小鼠FI水平顯著增加,且16周比8周更加明顯,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與NCD組相比,8周和16周時(shí)HFD組HOMA-IR明顯升高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。與HFD組相比,HFD+1000 nmol/L BPA組HOMA-IR在16周時(shí)明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.2 GSK3β抑制劑對(duì)BPA暴露誘導(dǎo)小鼠FG、FI及HOMA-IR改變的影響與HFD組相比,8周和16周時(shí)HFD+GSK3β抑制劑組小鼠FG明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與HFD+1000 nmol/L BPA組相比,HFD+1000 nmol/L BPA+GSK3β抑制劑組小鼠FG在16周時(shí)顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與HFD組相比,HFD+GSK3β抑制劑組小鼠FI水平在16周時(shí)明顯降低。與HFD+1000 nmol/L BPA組相比,HFD+1000 nmol/L BPA+GSK3β抑制劑組小鼠FI水平在16周時(shí)明顯降低,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與HFD組相比,8周和16周時(shí)HFD+GSK3β抑制劑組小鼠HOMA-IR明顯降低,16周比8周更加明顯,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與HFD+1000 nmol/L BPA組相比,HFD+1000 nmol/L BPA+GSK3β抑制劑組小鼠HOMA-IR在16周時(shí)明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.3 BPA暴露對(duì)小鼠GTT和ITT的影響GTT曲線下面積(Area under curve,AUC)顯示,與NCD組相比,8周和16周時(shí)HFD組小鼠GTT的AUC明顯升高。與HFD組相比,8周和16周時(shí)HFD+1000nmol/L BPA組小鼠GTT的AUC明顯升高,16周比8周更加明顯,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。ITT的AUC顯示,與NCD組相比,8周和16周時(shí)HFD組小鼠ITT的AUC明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與HFD組相比,8周和16周時(shí)HFD+1000nmol/L BPA組小鼠ITT的AUC明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.4 GSK3β抑制劑對(duì)BPA誘導(dǎo)小鼠GTT和ITT改變的影響經(jīng)腹腔注射葡萄糖溶液后,GTT的AUC顯示,與HFD+1000nmol/L BPA組小鼠相比,8周和16周時(shí)HFD+1000nmol/L BPA+GSK3β抑制劑組小鼠GTT的AUC顯著下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。胰島素經(jīng)腹腔注入小鼠體內(nèi)后,ITT的AUC顯示,與HFD+1000nmol/L BPA組小鼠相比,8周和16周時(shí)HFD+1000nmol/L BPA+GSK3β抑制劑組小鼠ITT的AUC顯著下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4 GSK3β抑制劑對(duì)BPA誘導(dǎo)IR小鼠肝臟炎性損傷的影響4.1 BPA暴露對(duì)小鼠肝臟損傷的影響肝功能結(jié)果顯示,與HFD組相比,8周和16周時(shí)HFD+1000nmol/L BPA組血清中AST和ALT水平明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。肝臟組織病理學(xué)結(jié)果顯示,與NCD組比,8周和16周時(shí)HFD組小鼠肝臟組織病理改變加重。與HFD組相比,8周和16周時(shí)HFD+1000nmol/L BPA組小鼠肝臟組織病變更為嚴(yán)重。4.2 GSK3β抑制劑對(duì)BPA暴露小鼠肝臟損傷的影響肝功能結(jié)果顯示,與HFD組相比,HFD+GSK3β抑制劑組小鼠血清中AST和ALT水平在16周時(shí)顯著下降。與HFD+1000nmol/L BPA組相比,8周和16周時(shí)HFD+1000nmol/L BPA+GSK3β抑制劑組小鼠血清AST、ALT水平明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。肝臟組織病理學(xué)結(jié)果顯示,與HFD組相比,8周和16周時(shí)HFD+GSK3β抑制劑組小鼠肝臟組織病理改變顯著緩解。與HFD+1000nmol/L BPA組相比,8周和16周時(shí)HFD+1000nmol/L BPA+GSK3β抑制劑組小鼠肝臟病變明顯改善。4.3 BPA暴露對(duì)小鼠肝臟組織炎癥因子的影響與NCD組相比,8周和16周時(shí)HFD組小鼠肝臟組織中TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)明顯增強(qiáng)。與HFD組相比,8周和16周時(shí)HFD+1000nmol/L BPA組小鼠肝臟組織中TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)均顯著上升,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.4 GSK3β抑制劑對(duì)BPA暴露小鼠肝臟組織炎癥因子的影響與HFD組相比,8周和16周時(shí)HFD+GSK3β抑制劑組小鼠肝臟組織IL-1β表達(dá)在8周和16周時(shí)均顯著降低,TNF-α、IL-6表達(dá)在16周時(shí)顯著降低。與HFD+1000nmol/L BPA組相比,8周和16周時(shí)HFD+1000nmol/L BPA+GSK3β抑制劑組小鼠肝臟TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)明顯下降,且16周比8周更加明顯,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5 GSK3β抑制劑對(duì)BPA誘導(dǎo)IR小鼠肝臟GSK3β、p-GSK3β及胰島素信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響5.1 BPA暴露對(duì)小鼠肝臟GSK3β、p-GSK3β及胰島素信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響與NCD組相比,8周和16周時(shí)HFD組小鼠肝臟p-GSK3β表達(dá)明顯降低。與HFD組相比,8周和16周時(shí)HFD+1000 nmol/L BPA組小鼠肝臟p-GSK3β表達(dá)顯著下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與NCD組相比,8周和16周時(shí)HFD組小鼠肝臟p-IRS1、p-PI3K、p-AKT表達(dá)明顯下降。與HFD組相比,8周和16周時(shí)HFD+1000 nmol/L BPA組小鼠肝臟p-IRS1、p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)水平顯著降低,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5.2 GSK3β抑制劑對(duì)BPA暴露小鼠肝臟GSK3β、p-GSK3β及胰島素信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響與NCD組相比,8周和16周時(shí)NCD+GSK3β抑制劑組小鼠肝臟p-GSK3β表達(dá)明顯下降。與HFD組相比,8周和16周時(shí)HFD+GSK3β抑制劑組小鼠肝臟p-GSK3β表達(dá)均比對(duì)照組顯著升高。與HFD+1000nmol/L BPA組相比,8周和16周時(shí)HFD+1000nmol/L BPA+GSK3β抑制劑組小鼠肝臟p-GSK3β表達(dá)明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與HFD組相比,8周和16周時(shí)HFD+GSK3β抑制劑組小鼠肝臟p-IRS1、p-PI3K、p-AKT表達(dá)水平均顯著上升,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與HFD+1000 nmol/L BPA組相比,8周和16周時(shí)HFD+1000 nmol/L BPA+GSK3β抑制劑組小鼠肝臟p-IRS1、p-PI3K、p-AKT含量明顯升高,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論(1)低劑量BPA暴露可以加重誘導(dǎo)HFD小鼠IR和肝臟損傷發(fā)生。(2)低劑量BPA暴露可以引起其誘導(dǎo)的IR小鼠肝臟組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)增多和炎性因子表達(dá)上調(diào),并可顯著降低肝臟組織GSK3β-S9蛋白表達(dá)而導(dǎo)致GSK3β活化。(3)GSK3β抑制劑可上調(diào)BPA誘導(dǎo)的小鼠肝臟中GSK3β-S9水平從而導(dǎo)致GSK3β活性降低,可顯著緩解BPA誘導(dǎo)的IR,并可改善BPA誘導(dǎo)的IR小鼠肝臟病理?yè)p傷、導(dǎo)致肝臟炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少和炎性因子表達(dá)降低。
【學(xué)位單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R114
【部分圖文】：
膜放置在顯影版中央，根據(jù) Mark 的位置，吸取適量顯影液（一般在 20~40μl 之間）涂于所需檢測(cè)蛋白分子量條帶處，進(jìn)行顯影操作，得出所需條帶圖像并進(jìn)行保存。（9）蛋白條帶處理：免疫蛋白印跡法所檢測(cè)出的條帶圖像，可用 IPWIN32 軟件分析各條帶的光密度值，對(duì)條帶進(jìn)行定量，化為數(shù)值后對(duì)數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。2.9 統(tǒng)計(jì)分析方法本研究的數(shù)據(jù)資料用 SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行錄入統(tǒng)計(jì)和分析，以 x s表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（One-WayANOVA），組間比較采用 LSD檢驗(yàn)；P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.10 實(shí)驗(yàn)流程圖
無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖 2、3。圖 2 每只小鼠周平均飲食量（x s）Figure 2 Average weekly food intake per mouse（x s）
GSK3β抑制劑對(duì)小鼠體重的影響（x s）。與 NCD 組相比：*P<0.05；組相比：#P<0.05；與 HFD+1000nmBPA 組相比：△P <0.05。Effect of BPAand GSK3β inhibitor on body weight of mice（x s）. Compaup:*P<0.05; compared with HFD group:#P<0.05; compared with HFD+1000ngroup:△P<0.05.
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2871991
