發(fā)布時間：2020-11-04 15:34

　　 目的:流行病學調(diào)查顯示大氣PM2.5與心臟發(fā)育疾病相關(guān),動物實驗也表明其導致心臟畸形,但目前分子機制尚不明確。我們以斑馬魚胚胎為研究模型,研究PM2.5有機提取物(extractable organic matter,EOM)的心臟發(fā)育毒性及葉酸(Follic Acid,FA)的保護作用,并從Ahr和Wnt/β-catenin信號通路的相互作用及DNA甲基化調(diào)控角度深入研究其分子機制。方法:(1)PM2.5收集:收集蘇州市區(qū)PM2.5,分析其成分并用索氏提取法提取有機組分。(2)整體胚胎實驗:取不同濃度的EOM對斑馬魚胚胎染毒,并給予Ahr抑制劑CH223191(CH)和β-catenin激活劑CHIR99021(CHIR),在體視顯微鏡下觀察72hpf時斑馬魚胚胎的發(fā)育情況,主要包括胚胎孵化率、心率、心臟畸形率;以qPCR檢測Ahr和Wnt/β-catenin通路相關(guān)基因mRNA的表達;以Western Blot檢測β-catenin蛋白的表達;以EROD實驗檢測Cyp1a1活性。(3)分離心臟實驗:用5mg/L濃度的EOM染毒斑馬魚胚胎,同時補充0.05μM葉酸,在體視顯微鏡下觀察72hpf時不同處理組的斑馬魚胚胎發(fā)育情況。分離出胚胎心臟,用qPCR和熒光顯微鏡檢測分離心臟的純度;以qPCR檢測不同處理組心臟中Ahr和Wnt/β-catenin通路及DNA甲基化相關(guān)基因mRNA的表達;以Western Blot檢測心臟中Ahr和β-catenin的蛋白表達水平;以COBRA檢測c-fos基因啟動子區(qū)甲基化水平;以EROD檢測Cyp1a1活性。結(jié)果:(1)EOM引起斑馬魚胚胎心臟畸形升高和心率下降,Ahr抑制劑CH和Wnt激活劑CHIR能拮抗EOM引起的心臟缺陷;EOM可以導致Ahr靶基因(Cyp1a1、Cyp1b1和Ahrra)表達的升高,降低β-catenin靶基因(Axin2,Nkx2.5和Sox9b)的表達,同時能降低Rspo2基因(β-catenin的上游基因)的表達;補充CH/CHIR能減輕EOM導致的大部分基因表達改變并引起Ahrrb(Ahr抑制基因)的表達升高。(2)補充葉酸降低EOM導致的斑馬魚心臟畸形,并且Ahr抑制劑CH和Wnt激活劑CHIR都提高了葉酸的保護效率。對于Ahr和Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)基因,EOM在分離的心臟中引起類似于全胚胎中的mRNA表達變化。EOM還引起DNA甲基化修飾相關(guān)基因mRNA表達異常以及DNA甲基化變化,補充葉酸則有拮抗作用。特別是EOM所致分離心臟中c-fos基因啟動子區(qū)DNA高甲基化和mRNA低表達在補充葉酸后均得到顯著改善。EROD實驗進一步驗證了葉酸抑制EOM對Cyp1a1的激活。此外,葉酸還拮抗EOM所引起的β-catenin和Ahr蛋白表達改變。結(jié)論:EOM能夠激活斑馬魚胚胎心臟中Ahr活性,并抑制Wnt/β-catenin信號通路,從而導致心臟發(fā)育畸形;葉酸可能通過穩(wěn)定DNA甲基化拮抗EOM引起的Ahr和Wnt/β-catenin信號通路變化。我們的研究提示葉酸可用于防治大氣PM2.5引起的先天性心臟疾病。
【學位單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R114
【部分圖文】：

PM2.5主要成分分布

圖 1.2 CH/CHIR 對 EOM 所致斑馬魚胚胎心臟畸形的影響(n=4)（圖A. 斑馬魚胚胎圖片，箭頭表示心臟畸形。0、0.2、1、5代表EOM的濃度（mg/L）B. 不同藥物處理的斑馬魚胚胎心臟畸形率統(tǒng)計； CH:CH223191；CHIR:CHIR99021;CCHIR的濃度分別為0. 5和1μM不同字母代表有統(tǒng)計學差異。）

補充CH/CHIR前后暴露于EOM中斑馬魚胚胎的心率和孵化率(n=4)
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本文編號：2870276