發(fā)布時間：2020-11-21 11:43

　　 鎘(Cadmium,Cd)是一種對人體健康威脅巨大的有毒重金屬。急性高劑量的Cd暴露可導(dǎo)致肝、腎等多個臟器的損傷,慢性低劑量的Cd脅迫又與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。Cd的生物半衰期長達10-30年,經(jīng)消化道吸收的Cd通過門靜脈首先到達肝臟并蓄積于此,因此,肝臟是Cd毒性重要的靶器官之一。在痛痛病患者中肝纖維化發(fā)生率顯著增高,肝纖維化可能是肝臟高Cd蓄積引起的特異性病理變化。流行病學(xué)顯示,慢性肝病的進展可能與Cd暴露有關(guān)。在動物實驗中,長時間Cd暴露可導(dǎo)致肝間質(zhì)纖維化。然而,Cd暴露在肝纖維化發(fā)生、進展中的作用機理尚不清楚。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)與肝纖維化發(fā)生及進展有關(guān)。肝損傷時,靜息狀態(tài)的HSC被激活轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞并產(chǎn)生αSMA和Ⅰ型膠原纖維參與肝纖維化的發(fā)生,而HSC活化狀態(tài)的維持又與肝纖維化的進展有關(guān)。因此,本研究擬從Cd暴露影響HSC的活化及其可能的氧化應(yīng)激機制著手,以闡釋Cd暴露在肝纖維化發(fā)生、進展的作用,為進一步理解Cd暴露的肝臟遠(yuǎn)期效應(yīng)提供證據(jù)。方法:(1)Cd染毒的動物實驗,分為4組:空白對照組、GSH對照組、Cd干預(yù)組及Cd+GSH干預(yù)組。利用生化分析儀檢測肝功能指標(biāo),HE染色檢測肝臟病理改變,Masson染色檢測肝組織中膠原分布,免疫組化檢測肝組織中αSMA的表達。透射電鏡下觀察肝細(xì)胞及HSC超微結(jié)構(gòu)的變化,分光光度儀或酶標(biāo)儀檢測肝組織中GSH,Vc,SOD,CAT和GSH-Px的水平,Western Blot檢測HSC活化標(biāo)志物,NF-κB及MAPK信號通路中相關(guān)蛋白的變化。(2)HSC的體外激活,利用Cd干預(yù)L02的條件培養(yǎng)基(CM)干預(yù)LX-2細(xì)胞,分3組:(L02-CM),(Cd-L02-CM)和(Cd+GSH-L02-CM),檢測LX-2中αSMA的表達。(3)利用質(zhì)譜流式對不同濃度Cd干預(yù)的LX-2細(xì)胞進行Cd信號及活力的檢測。多次低劑量Cd干預(yù)(0.5μM,2μM)對HSC-T6細(xì)胞表型及功能的影響,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡,ROS水平,CCK8實驗檢測細(xì)胞活力,劃痕及Transwell實驗檢測遷移能力,油紅O染色檢測細(xì)胞內(nèi)脂滴分布,熒光顯微鏡檢測ROS水平,Western Blot檢測HSC活化標(biāo)記物及Nrf-2和NF-κB信號通路中相關(guān)蛋白的表達。結(jié)果:1.Cd暴露誘導(dǎo)肝細(xì)胞氧化損傷,激活HSC。(1)Cd暴露與肝損傷。Cd干預(yù)組可使血清AST,GGT及XOD較對照組顯著升高(P0.05),給予GSH可降低上述肝損傷指標(biāo)(P0.05);肝組織HE染色顯示,Cd干預(yù)組出現(xiàn)炎細(xì)胞浸潤、肝細(xì)胞壞死等病理改變;透射電鏡下見Cd干預(yù)組細(xì)胞線粒體雙層膜及內(nèi)部嵴結(jié)構(gòu)破壞。(2)Cd暴露與HSC激活。Cd干預(yù)組肝組織中αSMA蛋白表達量增加,αSMA陽性細(xì)胞在脈管周圍區(qū)域有較多分布。透射電鏡下見Cd干預(yù)組HSC內(nèi)部脂滴消失且周圍有膠原纖維。而Cd+GSH組較Cd干預(yù)組αSMA蛋白表達量下降(P0.05),αSMA陽性細(xì)胞主要分布在血管壁,電鏡下HSC內(nèi)富含脂滴,呈靜息狀態(tài)。(3)Cd暴露與體內(nèi)氧化還原狀態(tài)的改變。Cd干預(yù)組肝臟中小分子抗氧化物GSH及Vc含量升高,但SOD,CAT和GSH-Px等抗氧化酶的活性降低,而Cd+GSH干預(yù)組,小分子抗氧化物GSH和Vc升高(P0.05),抗氧化酶SOD,CAT的活性較對照組無明顯變化,GSH-Px活性升高(P0.05)。(4)Cd暴露與NF-κB和MAPK信號通路內(nèi)相關(guān)蛋白表達的改變。Cd干預(yù)組增加p-P65,p-IKBα及p-JNK蛋白的表達(P0.05);Cd+GSH干預(yù)組,上調(diào)p-P65蛋白,但p-JNK的表達量較對照組無明顯變化(P0.05)。(5)HSC的體外激活。GSH干預(yù)可降低L02細(xì)胞中Cd含量及ROS的生成,Cd-L02-CM干預(yù)后的LX-2細(xì)胞αSMA表達增加。2.Cd干預(yù)對肝星狀細(xì)胞表型及功能的影響。(1)LX-2細(xì)胞Cd攝取及活力。利用不同濃度Cd干預(yù)LX-2 1h后,5μM Cd干預(yù)組~(114)Cd陽性細(xì)胞比例為98.88%;其~(114)Cd中位信號強度為77.15,高于其他組;對照組、0.5μM和5μM CdCl_2干預(yù)組~(195)pt強陽性細(xì)胞(代表細(xì)胞活力差)的比例分別為11.32%,15.46%和35.5%。CCK8檢測發(fā)現(xiàn)5μM Cd干預(yù)可抑制LX-2細(xì)胞增殖。(2)多次低劑量Cd干預(yù)后,對HSC-T6細(xì)胞功能及表型的影響。對照組、0.5μM和2μM CdCl_2干預(yù)組HSC-T6細(xì)胞凋亡率未見差異;多次0.5μM Cd干預(yù)后,HSC-T6增殖、遷移能力增強。油紅O染色可見對照組細(xì)胞內(nèi)脂滴較多見,而Cd干預(yù)組脂滴較少。同樣的,Cd干預(yù)后纖維化相關(guān)蛋白αSMA表達量增加,多次Cd干預(yù)后的HSC-T6再次Cd干預(yù)時Cd攝取能力降低,其p-P65,HO-1蛋白表達量也較對照組增加。(3)低劑量Cd干預(yù)后對高劑量Cd暴露的影響。2μM+30μM Cd干預(yù)組可在一定程度上對抗高Cd毒性,其細(xì)胞活力高于其他組。2μM+30μM Cd干預(yù)組ROS生成較少,而0+30μM及0.5+30μM Cd干預(yù)組可見ROS強陽性峰。結(jié)論:(1)Cd可能通過降低抗氧化酶活性,上調(diào)p-JNK蛋白,促進ROS生成,誘導(dǎo)肝細(xì)胞氧化損傷,激活HSC。而外源性給予GSH,可減少細(xì)胞內(nèi)Cd攝取,一定程度恢復(fù)抗氧化酶活性,并可能通過上調(diào)p-P65,抑制p-JNK蛋白表達,減輕氧化損傷,減少HSC激活。(2)Cd可影響活化HSC的功能及表型。多次低劑量的Cd干預(yù)HSC后,HSC活化相關(guān)標(biāo)志物表達增加,細(xì)胞增殖、遷移能力增強。其活化狀態(tài)及拮抗高Cd毒性能力的改變可能與上調(diào)HO-1,p-P65等蛋白表達有關(guān)。(3)質(zhì)譜流式技術(shù)可作為一種研究Cd單細(xì)胞毒理的新工具。
【學(xué)位單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R575
【部分圖文】：

圖 1-2 人體內(nèi) Cd 的吸收、代謝、儲存及排泄[23].1-2 The process of absorption, metabolism, storage and excretion of Cd in human body在動物試驗中，急性 Cd 暴露可導(dǎo)致肝損傷，病理表現(xiàn)為局灶性肝細(xì)胞壞核固縮，炎細(xì)胞浸潤并有血清 ALT 和 AST 升高[24-26]。單次高劑量 C鼠 6 h 后，肝臟的超微結(jié)構(gòu)主要表現(xiàn)為線粒體腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)嚴(yán)重擴化并伴核糖體減少[27]。Cd 致急性肝損傷的機制可分為直接損傷和繼直接損傷主要包括氧化應(yīng)激，含巰基基團抗氧化物的失活，線粒體損傷發(fā)損傷通常由 Kupffer 細(xì)胞的激活并導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生[28]。長時間的，可誘發(fā) NFS 小鼠產(chǎn)生肝臟腫瘤[29]。此外，在乙型病毒性肝炎表面抗轉(zhuǎn)基因小鼠中，同時給予 Cd 暴露，可使腫瘤分化更差[29]。細(xì)胞死亡表型轉(zhuǎn)化是細(xì)胞對持續(xù)性 Cd 刺激響應(yīng)的兩種常見結(jié)局[30]。體外試驗濃度的 Cd 可以誘導(dǎo)不同種屬來源的肝細(xì)胞發(fā)生自噬，凋亡，焦亡等不死亡[31-33]。長時間低劑量 Cd 干預(yù)(1 μM，28 周)使大鼠肝臟 TRL121

圖 1-3 HSC 的活化的途徑[149]，HSC 的活化可分為起始刺激和活化維持。Fig.1-3 Pathways of hepatic stellate cell activation[149], Features of stellate cell activation canbe distinguished between those that stimulate initiation and those that contribute to perpetuation.1.2.7 金屬蓄積與肝纖維化病毒性肝炎，酒精性肝病是肝纖維化的常見病因，這些肝病以炎性細(xì)胞不斷浸潤，膠原持續(xù)堆積為特征。有研究表明氧化應(yīng)激可以參與調(diào)節(jié)膠原的生成及纖維化的形成。而金屬離子（Cu2+，F(xiàn)e2+等）作為天然的自由基反應(yīng)的催化劑具有調(diào)控肝纖維化的潛質(zhì)[150]。此外，許多研究表明在肝硬化患者中存在金屬元素代謝的紊亂，表現(xiàn)為檢測的生物樣本中出現(xiàn)必需元素的減少和毒性重金屬的增加，而這種紊亂可能是肝病發(fā)展的一個重要原因[42, 43]。鐵（ferrum, Fe）是人體必需的微量元素，其作為多種分子的組分參與機體代謝反應(yīng)。體內(nèi)的非血基質(zhì)Fe可嵌入酶的Fe-S中心，調(diào)節(jié)基因編碼酶的生成并參與細(xì)胞的增殖和分化[151]。肝臟是Fe貯藏及鐵調(diào)蛋白合成的主要器官。研究表明肝纖維化及肝硬化進展的過程與肝細(xì)胞內(nèi)Fe超載關(guān)系密切。機體中銅、Fe含量

蘭州大學(xué)博士研究生學(xué)位論文 鎘暴露影響肝星狀細(xì)胞活化及其氧化應(yīng)激機制研究 為肝纖維化的主要效應(yīng)細(xì)胞，在肝纖維化發(fā)生及進展中起重要作用，HSC 的激活可促肝纖維化發(fā)生，而其持續(xù)活化狀態(tài)又與肝纖維化進展密切相關(guān)。綜上，本研究擬從 Cd 暴露影響 HSC 的激活與活化狀態(tài)及其可能的氧化應(yīng)激機制著手，闡釋 Cd 暴露在影響肝纖維化進程中的作用。主要包括兩部分：一、通過體內(nèi)及體外實驗研究 Cd 暴露誘導(dǎo)肝細(xì)胞氧化損傷對 HSC 激活的影響；二、通過低劑量 Cd 對部分活化的肝星狀細(xì)胞株進行干預(yù)，探討低劑量 Cd 暴露后對活化 HSC 功能及表型的影響，此外，本部分還將利用質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)探討其在單細(xì)胞內(nèi) Cd 含量測定及細(xì)胞活力的運用，從單細(xì)胞層面全新視角揭示 Cd 的毒性效應(yīng)，為 Cd 毒性機理研究提供一種新的研究策略。本研究通過探討 Cd 暴露如何影響 HSC 的活化及可能的氧化應(yīng)激，為進一步深入理解 Cd 暴露的肝臟遠(yuǎn)期效應(yīng)提供實驗的依據(jù)。技術(shù)路線見下圖 1-4／1-5。
【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 高冀蓉;;脂肪肝的類型[J];家庭醫(yī)學(xué);2016年11期

2 展玉濤,魏紅山,李定國;肝星狀細(xì)胞活化的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)[J];臨床肝膽病雜志;2000年03期

3 展玉濤;肝星狀細(xì)胞活化的功能改變[J];國外醫(yī)學(xué)(消化系疾病分冊);1999年01期

4 左雁;陳文玲;胡嚴(yán)勻;石安華;王憲東;陳文慧;;細(xì)胞自噬、肝星狀細(xì)胞活化與肝纖維化的關(guān)系[J];山西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2016年06期

5 羅雨欣;張曉嵐;;肝星狀細(xì)胞活化、增殖的免疫調(diào)控機制研究[J];臨床薈萃;2017年03期

6 郭圓圓;樊圓圓;張永婷;王瑜;王媛慧;蔡潔;李軍;章莉莉;;間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清抑制星狀細(xì)胞活化治療肝纖維化的研究[J];南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2017年09期

7 蔡曉波;范建高;田麗艷;錢燕;;高血糖對大鼠肝星狀細(xì)胞活化及轉(zhuǎn)化生長因子-β1和結(jié)締組織生長因子表達的影響[J];肝臟;2006年02期

8 潘勤,陸良勇,李定國,尤漢寧,徐芹芳;生長抑素受體與肝星狀細(xì)胞活化的相關(guān)性研究[J];中華消化雜志;2004年06期

9 潘傳芳,劉成海;瘦素促進大鼠肝星狀細(xì)胞活化及其細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶磷酸化[J];中華消化雜志;2005年08期

10 鄧欣,朱清靜,聶廣,楊大國,吳其愷,劉成海;剔毒護肝方對肝星狀細(xì)胞活化的調(diào)控作用(摘要)[J];中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志;2000年S1期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前4條

1 任龍飛;鎘暴露影響肝星狀細(xì)胞活化及其氧化應(yīng)激機制研究[D];蘭州大學(xué);2019年

2 潘若浪;間充質(zhì)干細(xì)胞抗肝臟纖維化作用及其機制的探索研究[D];浙江大學(xué);2011年

3 何嘉怡;SATB1在肝星狀細(xì)胞活化和大鼠肝纖維化形成中作用機制的研究[D];華中科技大學(xué);2015年

4 段妍君;參杖顆粒調(diào)控Rho/Rho激酶途徑對肝星狀細(xì)胞活化影響的研究[D];湖北中醫(yī)藥大學(xué);2014年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 楊瓊;Nucleophosmin在肝星狀細(xì)胞活化中的作用及其機制研究[D];廈門大學(xué);2017年

2 許紫薇;二氫楊梅素通過鐵自噬途徑抑制鐵過載誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞活化[D];南華大學(xué);2018年

3 王曉航;胰島星狀細(xì)胞活化的關(guān)鍵基因篩選及其鑒定[D];東南大學(xué);2018年

4 潘春曉;酸敏感離子通道1a對PDGF誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞活化的影響及其可能機制[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2014年

5 焦黎;纖溶酶原激活物抑制因子-1對肝星狀細(xì)胞活化及其細(xì)胞外基質(zhì)的影響[D];山西醫(yī)科大學(xué);2011年

6 汪長發(fā);Akt抑制肝星狀細(xì)胞活化的實驗性研究[D];中南大學(xué);2007年

7 段小鵬;神經(jīng)纖毛蛋白-1 siRNA對PDGF-BB刺激肝星狀細(xì)胞活化、增殖及遷移的影響[D];南方醫(yī)科大學(xué);2012年

8 黃思敏;姜黃素對大鼠肝星狀細(xì)胞活化相關(guān)細(xì)胞因子表達的影響[D];暨南大學(xué);2006年

9 雷淑娟;MicroRNA-134通過調(diào)控TAB1的表達抑制肝星狀細(xì)胞活化[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2017年

10 畢曉娟;miRNA-133a在泡球蚴感染所致肝星狀細(xì)胞活化中作用及與肝纖維化的關(guān)系[D];新疆醫(yī)科大學(xué);2016年

本文編號：2892947