發(fā)布時間：2020-11-18 04:42

　　 非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是以脂滴(lipid droplets,LDs)過度沉積于肝臟為特征的脂代謝紊亂疾病,可直接導致非酒精性脂肪肝炎、肝硬化、最終發(fā)展成肝癌。萊菔硫烷(sulforaphane,SFN)是富含于十字花科蔬菜中的一種異硫氰酸酯(isothiocyanates,ITCs)類植物化學物,具有多種生物學功能。前期研究發(fā)現(xiàn),SFN能夠改善糖尿病、肥胖和酒精性肝損傷等糖脂代謝紊亂引起的代謝型疾病,但SFN對高脂攝入引起的NAFLD是否也具有改善作用,及可能的作用機制尚未見報道。本文采用高脂膳食(highfat diet,HFD)建立NAFLD整體動物模型,以脂肪酸(fatty acid,FA)誘導HHL-5肝細胞為體外模型,并以SFN為干預因素,內質網(wǎng)(ER)與線粒體(MT)偶聯(lián)區(qū)(MAM)作為主要研究核心,探討SFN對肝臟脂滴形成的影響和改善NAFLD的分子機制。分別用HFD喂養(yǎng)大鼠10周,250 μmol/LFA誘導HHL-5肝細胞5 d,成功建立體內及體外肝細胞脂肪變模型。分別以不同劑量SFN(5,10,20 mg/kg)經口灌胃大鼠10周,及SFN(1,5,10,20μmol/L)處理HHL-5肝細胞,可降低大鼠血清和肝臟及HHL-5肝細胞中甘油三酯(TG)和總膽固醇(TC)含量。HE和油紅O染色病理觀察發(fā)現(xiàn),SFN明顯改善肝臟病理損傷,減少脂滴數(shù)量和平均面積。采用Western blot方法檢測脂滴核心組份TG和TC合成關鍵酶二脂酰甘油�；�轉移酶2(DGAT2)和膽固醇�；�轉移酶(ACAT1)蛋白水平發(fā)現(xiàn),SFN抑制其表達。Real-time PCR、免疫組化和Western blot方法檢測脂滴表面結構蛋白發(fā)現(xiàn),SFN抑制大鼠肝臟PLIN2和PLIN5 mRNA及蛋白水平表達;FA誘導HHL-5肝細胞10 d,PLIN2和PLIN5表達逐漸上升,SFN從第3 d到第10 d下調PLIN2和PLIN5表達。SFN抑制PLIN2/PLIN5的轉錄因子PPARγ表達;PPARγ興奮劑Tro處理HHL-5肝細胞,TG含量上升,PLIN2及PLIN5表達上調。PPARγ興奮和過表達后,SFN不再抑制PLIN2和PLIN5表達。上述結果提示,SFN不僅降低了脂滴脂肪核心的含量,更是通過抑制PPARγ下調脂滴外周蛋白PLIN2及PLIN5的表達,抑制脂滴形成。FA是合成脂滴脂肪核心的底物,Real-time PCR和Western blot方法檢測FA合成相關酶ACC1、SCD1和FAS及其轉錄因子SREBP1c表達發(fā)現(xiàn),SFN下調其mRNA及蛋白表達。動態(tài)觀察發(fā)現(xiàn),FA作用24 h后,SFN即下調SREBP1c;FA作用3d后,細胞內TG含量明顯減少。ER是合成FA的關鍵細胞器,肝細胞透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn),SFN可明顯修復ER的生理形態(tài),減輕ER腫脹,縮短ER周長;同時改善MT生理形態(tài)。內質網(wǎng)應激(ERS)是調控FA合成相關酶的重要途徑,Western blot檢測發(fā)現(xiàn),SFN下調ERS標志蛋白GRP78表達,降低ERS元件XBP1和PERK的mRNA及蛋白水平表達。采用ERS抑制劑4-PBA處理細胞,XBP1和SREBP1c mRNA表達被抑制,TG含量減少,脂滴形成也明顯減少;可見,SFN與ERS抑制劑4-PBA作用類似。綜上,SFN通過ERS 兩條途徑 XBP1-ACC1/SCD1 和 PERK-SREBP1c-FAS 減少脂質積累。ERS發(fā)生后,MT與ER形態(tài)和功能的變化使二者形成結構偶聯(lián)區(qū)(MAM)。透射電鏡觀察大鼠肝臟及MT粗提物發(fā)現(xiàn),SFN減輕了肝細胞中MT的膨脹,拉開MT與ER之間的距離,明顯下調MAM區(qū)連接蛋白PACS2的表達,提示SFN有促進MAM區(qū)解體的傾向。SFN明顯降低胞漿及MT中Ca2+濃度,從而降低MAM區(qū)內通訊信號分子活動。Western blot檢測發(fā)現(xiàn),SFN下調ER膜上Ca2+釋放通道蛋白IP3R表達和MT內膜上吸收Ca2+的鈣離子單向轉運蛋白MCU的表達。SFN抑制MAM區(qū)中脂滴脂肪核心合成酶DGAT2和ACAT1的表達。高脂攝入嚴重損害MT的DNA(mtDNA)合成,SFN升高mtDNA表達量,恢復MT膜電位,減少ROS產生,從而減輕MT損傷。SFN提高MT氧化呼吸鏈中復合物IV的活性,促進ATP合成,改善能量代謝。綜上,SFN抑制高脂誘導的肝細胞脂滴形成,其作用機制與抑制ERS,下調MAM區(qū)內Ca2+相關蛋白表達、促進MT的氧化磷酸化有關。
【學位單位】：哈爾濱工業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R575
【部分圖文】：

??ＰＩＴＣ），ＰＥＩＴＣ以及生物活性研究最為廣泛的ＳＦＮ?（圖１－２）?［１２］。西蘭花中ＳＦＮ??含量最為豐富，西蘭花芽中的ＳＦＮ含量比成熟面蘭花中的含量高２０到５０倍??（約為６?ｍｍｏｌ／ｇ鮮重??Ｏ??ＩＩ??ＣＨ３—Ｓ—ＣＨ２——ＣＨ２—ＣＨ２—ＣＨ２—Ｎ?＝?Ｃ＝Ｓ?ＳＦＮ??ＣＨ２＝ＣＨ—ＣＨ２—Ｎ?＝?Ｃ＝Ｓ?ＡＩＴＣ??＜〇）－?ＣＨ２—Ｎ?＝?ｃ＝ｓ?ＢＩＴＣ??Ｚ〇ｙ—ｎ＝ｃ＝ｓ?ｐｉｔｃ??ＣＨ２—ＣＨ２—Ｎ?＝?Ｃ＝Ｓ?ＰＥＩＴＣ??圖１－２幾種常見的ＩＴＣｓ的化學結構??Ｆｉｇ．?１－２?Ｔｈｅ?ｃｈｅｍｉｃａｌ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ?ｏｆ?ｓｅｖｅｒａｌ?ｃｏｍｍｏｎ?ＩＴＣｓ??ＭＹＲ最唯一己知的特異性水解ＧＲＰ產生ＩＴＣｓ的酶，通常存在于植物的??嗜黑細胞內。例如，擬南芥富含硫的細胞（Ｓ細胞）中ＧＲＰ濃度極高（＞１３０??ｍｍｏｌ／Ｌ）；?Ｓ細胞位于韌皮部和內胚層之間，而ＭＹＲ位于鄰近的韌皮部薄壁??組織中在十字花科植物中，ＭＹＲ活性在種子和幼苗階段最高＾從甘藍中??分離出的ＭＹＲ的Ｈ維模型結構如圖１－３所示，其活性位點ＴＨＲ２１０，?ＡＳＮ３４８??和ＴＹＲ３５０存在于ＭＹＲ的結合口袋中，用于底物結合８１＾￥１１活性位點與ＧＲＰ??分子對接

哈獻太ｔｅｆ＃遍德ｉｔ文???ｍｇ／ｋｇ。高：齊丨丨讀：ＳＦＮ（?３００?ｍｇ／ｋｇ）隹射小爾能在幾分鐘啟產：生：明顯的鎮(zhèn)靜作用．，??使體溫過低，３ｈ后死亡ｉ血液分析Ｍ示注射了?ＳＦＮ（２００ｍｇ／ｋｇ）的小鼠發(fā)生??ｆｉ細胞減少癥；ＳＦＮ（１５０ｍｇ／ｋｇ）注射ｌｈ后，小鼠運動協(xié)調受損；減少骨骼??肌肉力項人群實驗評價了健康人多次攝入ＰＥＩＴＣ的耐受性和安全性＾??結果表明，以１２０ｍｇ／Ｓ剤量給ＰＥＩＴＣ，連續(xù)３０ｄ，有冑腸不適和腹瀉等不良??反應，怛均為輕度［１７］。可見，ＩＴＣｓ引起的不良反應與其攝入量５Ｅ相關。而各??國人群對十字花科蔬菜９：常攝入量釣為５？１００?ｇ／ｄ，Ｈ攝入１１．３?ｇ十字花科??蔬菜，相舍于攝入６．５?ｍｇ?ＧＲＰ［１８］。一項人群實驗表明，以食用西蘭花方式攝??入相當于１６?｜ｉｍｏｌ?（低剤量５或５２?ｐｍｏｌ?Ｃ高剤量》ＳＦＮ后，ＳＦＮ及其代謝產??物的血漿濃度迅速增加，分別在１．５?ｈ和２ｈ達到最大值２．２±０．８?｜ｉｍｏｌ／Ｌ和７．３±??２．９｜ｉｍ〇ｌ／Ｌ［１１］。可見，ＩＴＣｓ日常攝入量遠小于其能夠引起不適反應的劑董ｗ??

ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ２，ＤＧＡＴ２）和酰基輔酶Ａ：膽固醇�；�轉移酶（ａｃｙｌ?ｃｏｅｎｚｙｍｅ??Ａ：ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｌ，ＡＣＡＴ１），且都部分存在于?ＥＲ?中［８Ｑ］。脂滴形成??如圖１－６：新合成的脂質沉積在ＥＲ膜中，當數(shù)量超過磷脂雙層膜中可以同化??的摩爾比例時，脂質開始從膜結構中分離出來脂質逐漸向細胞質膨脹，并??且作為新生脂滴從母膜中分離。這個假設給出了磷脂單層覆蓋的脂質小球是如??何由磷脂雙層膜中形成的合理解釋。然而，每個步驟的實驗證據(jù)仍然相當稀少。??脂滴有幾種可能的增長方式，其中，脂滴的相互融合是一種可能性極大的機制。??在脂滴融合過程中，脂質的總體積幾乎保持恒定，融合后的脂滴立即恢復成球??形，這樣會引起單層磷脂膜及其鑲嵌蛋白質過剩。此時，脂滴可能通過內質網(wǎng)??－１２?－??
【參考文獻】

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本文編號：2888332