發(fā)布時間：2020-11-17 08:39

　　 一、未抗病毒治療的慢性HBV感染者肝內(nèi)HBV ccc DNA耐藥相關(guān)位點變異的檢測 目的證實未抗病毒治療的慢性HBV感染者肝內(nèi)HBV ccc DNA存在耐藥相關(guān)位點的變異,了解肝內(nèi)HBV變異病毒株與血中的異同。方法①挑選出85例未經(jīng)抗病毒治療的慢性HBV感染者,留取肝穿組織和血清。②用QIAamp? DNA Mini Kit試劑盒和直接煮沸法分別抽提肝穿組織、血清中的HBV相關(guān)基因。③以不降解質(zhì)粒的ATP依賴DNA酶(PSAD)酶切純化肝穿組織中的HBV DNA。定量酶切前后肝內(nèi)HBV DNA載量以及血清中HBV DNA載量。④檢測血清乙型肝炎病毒血清免疫標志物和血清肝功能生化指標(ALT),分析其與HBV含量之間的關(guān)系。⑤應用本實驗室設計的兩對跨雙缺口引物行巢式聚合酶鏈反應(PCR)擴增HBV ccc DNA、兩對非跨雙缺口引物行巢式PCR擴增松弛環(huán)狀DNA(rc DNA)。所有引物擴增的片段涵蓋拉米夫定、阿德福韋酯、恩替卡韋常見已知耐藥位點。⑥應用直接測序法對巢式PCR的DNA產(chǎn)物進行測序檢測,觀察耐藥相關(guān)變異位點的變異情況。⑦對比分析肝內(nèi)HBV ccc DNA、HBV rc DNA和血清中HBV DNA的基因序列。結(jié)果肝內(nèi)HBV ccc DNA水平、肝內(nèi)HBV DNA水平以及血清HBV DNA三者之間的關(guān)系呈正相關(guān)(P0.05);肝功能指標ALT水平與HBV DNA載量之間沒有相關(guān)性(P0.05);在85例患者中,HBV ccc DNA耐藥相關(guān)位點變異陽性兩例(2.4%):204位點變異一例rtM204I(45號),214位點變異一例(49號)。另有一例測序圖譜顯示雜峰(85號)。且相應的血清及肝組織HBV DNA中也都發(fā)現(xiàn)同樣變異。結(jié)論在未經(jīng)抗病毒治療的慢性HBV感染者肝內(nèi)HBV ccc DNA中發(fā)現(xiàn)耐藥相關(guān)位點變異,證實HBV ccc DNA存在耐藥相關(guān)位點自然變異。 二、HBV ccc DNA耐藥相關(guān)位點自然變異病毒株目的基因片段的克隆分析 目的了解出現(xiàn)HBV ccc DNA耐藥相關(guān)位點自然變異的患者體內(nèi)HBV的變異株與野生株所占比例。方法①以第一部分試驗出現(xiàn)變異的標本(血清及酶切前后肝內(nèi)HBV相關(guān)基因)為克隆模板。巢式PCR法同第一部分。②按照克隆試劑盒的具體步驟(純化、連接、轉(zhuǎn)化等)完成操作。觀察克隆結(jié)果,每份標本隨機挑取50個單克隆菌落,直接測序。③對測序結(jié)果進行比對分析,了解每份標本的變異株與野生株的比例。結(jié)果①204位點克隆分析:肝內(nèi)HBV ccc DNA ATG/ATT/ATC=10/38/2、肝內(nèi)HBV rc DNA ATG/ATT/ATC=3/45/2、血清HBV DNA ATG/ATT/ATC=0/50/0;②214位點克隆分析:肝內(nèi)HBV ccc DNA GTA/GCT/GTT=20/29/1、肝內(nèi)HBV rc DNA GTA/GCT =5/45、血清HBV DNA GTA/GCT=10/40;③85號雜峰標本克隆分析結(jié)果顯示大部分耐藥相關(guān)位點變異是無義突變,僅在肝內(nèi)HBV ccc DNA目的基因片段的50例克隆中發(fā)現(xiàn)1例181位點GCT變?yōu)锳CT(rtA181T),在血清HBV DNA目的基因片段的50例克隆中發(fā)現(xiàn)1例250位點ATG變?yōu)镚TG(rtM250V)。結(jié)論肝內(nèi)ccc DNA耐藥相關(guān)位點發(fā)生自然變異的患者體內(nèi)病毒株為變異株與野生株混合存在,肝內(nèi)HBV ccc DNA、rc DNA及血清HBV DNA的變異株和野生株比例不一致。85號標本的克隆分析提示此HBV病毒株存在較多無義突變,但不影響HBV基因表達。
【學位單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2011
【中圖分類】：R512.62
【部分圖文】：

第二軍醫(yī)大學碩士學位論文探針S體系）和HBVccc DNA的定量體系（HF/HR/TaqMan探針H體系）進行擴增，獲得的HBV DNA和HBV ccc DNA實時擴增曲線（界面如圖2-1、圖2-2所示），并通過PCR儀器自帶軟件構(gòu)建標準曲線。

圖2-2 HBV cccDNA實時擴增曲線界面圖中的縱坐標為熒光信號強度Rn，橫坐標為擴增循環(huán)數(shù)從左至右的指數(shù)曲線依次對應1×109~1×103拷貝/ml 的定量標準品，A圖中縱坐標0.16 、B圖中縱坐標0.07對應的橫線為設定的閾值線，閾值和擴增曲線的交匯點所對應的循環(huán)數(shù)即為Ct值，與模板濃度對數(shù)呈負線性相關(guān)。- 18 -

乙型肝炎病毒共價閉合環(huán)狀 DNA 耐藥相關(guān)位點自然變異的檢測及結(jié) 果一、DNA測序結(jié)果在85例患者中，HBV cccDNA 耐藥相關(guān)位點變異陽性兩例(2.4%)：204位點變一例（44號標本，見后圖3），214位點變異一例（49號標本，見后圖4）。另有一測序圖譜顯示雜峰（85號標本，見后圖5）。且相應的血清及肝組織HBV DNA中也發(fā)現(xiàn)同樣變異。二、 巢式 PCR 產(chǎn)物的電泳結(jié)果因樣本較多，僅取變異標本（編號 44/49/85）為代表。HBV ccc DNA 電泳如6-1；HBV rc DNA 電泳如圖 6-2。M 為 DNA Ladder；（+）為陽性對照；（—）為性對照。
【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 趙克開,繆曉輝,徐文勝;HepG2.2.15細胞內(nèi)乙型肝炎病毒cccDNA的定量檢測[J];中華傳染病雜志;2005年01期

2 Cha-Ze Lee;Hsuan-Shu Lee;Guan-Tarn Huang;Jin-Chuan Sheu;;Detection of YMDD mutation using mutant-specific primers in chronic hepatitis B patients before and after lamivudine treatment[J];World Journal of Gastroenterology;2006年33期

3 Dieter Glebe;;Recent advances in hepatitis B virus research:A German point of view[J];World Journal of Gastroenterology;2007年01期

本文編號：2887295