發(fā)布時間：2020-11-16 05:16

　　 目的:結(jié)締組織生長因子(CTGF)是新近發(fā)現(xiàn)的一種促肝纖維化的重要細(xì)胞因子,是轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factorβ,TGF-β)信號傳導(dǎo)途徑的下游效應(yīng)介質(zhì)。CTGF可直接介導(dǎo)原代肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)活化、增殖及遷移,還能促進(jìn)活化HSC的合成及分泌細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)。金屬蛋白酶組織抑制因子1(TIMP-1)也是TGF-β信號傳導(dǎo)途徑的下游效應(yīng)介質(zhì),在肝纖維化發(fā)生時,它主要由激活的HSC表達(dá)。TIMP-1不僅抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)活性阻止膠原降解,也通過抑制HSC凋亡、促進(jìn)膠原分泌而在肝纖維化病情進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。所以,減少CTGF和TIMP-1的表達(dá),可以減輕肝纖維化程度。本研究旨在構(gòu)建以大鼠CTGF或TIMP-1基因?yàn)榘悬c(diǎn)的短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA, shRNA)表達(dá)載體,為進(jìn)一步探索肝纖維化的基因治療提供有力工具。方法:根據(jù)前期篩選出的對CTGF和TIMP-1基因最有效的RNA干擾靶位,即CTGF基因1560～1580nt和TIMP-1基因412～432nt ,按照RNA干擾(RNA interference,RNAi)序列設(shè)計原則,各設(shè)計1對含有短發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNAi靶點(diǎn)序列,退火形成雙鏈DNA,分別克隆到經(jīng)雙酶切后的質(zhì)粒載體psiRNA-h7SKGFPzeo,構(gòu)建成含目的靶基因片段的重組質(zhì)粒載體psiRNA-GFP-CTGF和psiRNA-GFP-TIMP-1,并對重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切瓊脂糖電泳和測序鑒定。結(jié)果:酶切證實(shí)以大鼠CTGF或TIMP-1基因?yàn)榘悬c(diǎn)的表達(dá)shRNA的目的基因片段分別被成功的克隆到質(zhì)粒載體psiRNA-h7SKGFPzeo中,測序結(jié)果證明重組質(zhì)粒載體的插入序列與設(shè)計的靶基因片段完全一致。結(jié)論:成功構(gòu)建靶向大鼠CTGF和TIMP-1最有效的RNA干擾靶位的shRNA表達(dá)質(zhì)粒重組體,為進(jìn)一步探索肝纖維化基因治療的新途徑打下了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：瀘州醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2009
【中圖分類】：R575.2
【部分圖文】：

快速旋轉(zhuǎn)含有低溫凍干的質(zhì)粒的 EP 管，使質(zhì)粒 DNA 成為球形，用 20 μL 的無菌蒸餾水溶解 20μg 的質(zhì)粒，使之形成質(zhì)粒溶液 1μg/μl ，保存于-20 ° C 待用。

將平板置于室溫直至液體被吸收。（5）倒置平皿，于37℃恒溫細(xì)菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)，14–16小時后可出現(xiàn)淺藍(lán)色菌落(見圖2)。需注意：有的菌落可能為淺藍(lán)色，甚至顯色不明顯。（6）將出現(xiàn)藍(lán)色菌落的平板放于4℃冰箱數(shù)小時，可以使藍(lán)色菌落顯色充分。

輕輕混勻后，37°C 水浴加熱 3h，后置 80℃水浴 20min 滅活，即用或-20℃保存?zhèn)溆�。c. Hind III單酶切產(chǎn)物0.8﹪瓊脂糖電泳鑒定，見圖3M: maker DNA 6μl,6×緩沖液 1μl.1：提取質(zhì)粒10μl，6×緩沖液（0.25﹪溴酚藍(lán)）2μl.2：提取質(zhì)粒10μl，6×緩沖液（0.25﹪溴酚藍(lán)）2μl.3：空載質(zhì)粒5μl，6×緩沖液（0.25﹪溴酚藍(lán)）1μl.2.3 重組質(zhì)粒psiRNA-GFP-CTGF和 psiRNA-GFP-TIMP-1的制備2.3.1 空載質(zhì)粒psiRNA-h7SKGFPzeo用內(nèi)切酶ACC 65I和Hind III雙酶切和酶切產(chǎn)物瓊脂糖電泳a.空載質(zhì)粒psiRNA-h7SKGFPzeo用內(nèi)切酶ACC 65I和Hind III雙酶切
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