發(fā)布時間：2019-01-10 20:45

【摘要】：目的：從眼鏡蛇毒中分離出具有生物學(xué)活性的蛇毒神經(jīng)生長因子（Nervegrowthfactor，NGF），分析蛇毒NGF對肝星狀細(xì)胞（Hepaticstellatecells，HSC）凋亡、增殖及蛋白質(zhì)表達(dá)的影響，從細(xì)胞和蛋白組學(xué)水平探討蛇毒NGF抗纖維化作用的機(jī)理。 實驗方法： 根據(jù)實驗?zāi)康牟煌�設(shè)計的分組實驗方法具體如下： （1）貼壁細(xì)胞的MTT實驗分組：用單純培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞設(shè)為空白對照組，用眼鏡蛇毒神經(jīng)生長因子進(jìn)行干預(yù)（干預(yù)濃度依次為1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml）的細(xì)胞設(shè)為實驗組； （2）流式細(xì)胞術(shù)實驗分組：用單純培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞設(shè)為空白對照組，用眼鏡蛇毒神經(jīng)生長因子進(jìn)行干預(yù)（干預(yù)濃度依次為2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml）的細(xì)胞設(shè)為實驗組； （3）雙向電泳實驗分組：用單純培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞設(shè)為空白對照組，用眼鏡蛇毒神經(jīng)生長因子進(jìn)行干預(yù)（干預(yù)濃度依次為2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml）的細(xì)胞設(shè)為實驗組。 方法： （1）眼鏡蛇毒NGF通過ShephadexG-75凝膠柱和CMSepharoseCL-6B離子膠柱二步色譜法進(jìn)行分離純化； （2）各洗脫峰的生物學(xué)活性用PC12細(xì)胞測定，具有NGF生物學(xué)活性的洗脫峰純度和相對分子質(zhì)量用SDS-PAGE電泳方法鑒定； （3）采用MTT法檢測HSC-T6細(xì)胞的增殖是否受蛇毒NGF的影響； （4）采用流式細(xì)胞術(shù)檢測HSC-T6細(xì)胞的凋亡是否受蛇毒NGF的影響； （5）采用雙向電泳的方法探究HSC-T6細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)在蛇毒NGF干預(yù)前后是否存在差異； （6）對雙向凝膠電泳中差異表達(dá)在1.8倍及以上的蛋白質(zhì)點采用質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行鑒定； （7）對鑒定出的表達(dá)具有差異的蛋白質(zhì)點，利用生物信息學(xué)手段進(jìn)行分析（蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、GO分類及STRING網(wǎng)絡(luò)）； （8）蛋白質(zhì)印跡法（WesternBlot，WB）對差異的蛋白質(zhì)點進(jìn)行驗證。 結(jié)果： （1）眼鏡蛇毒粗毒經(jīng)ShephadexG-75凝膠柱粗分離得到3個峰，第二峰峰尖具有NGF活性；具有NGF活性的第二峰經(jīng)過CMSepharoseCL-6B離子膠柱再分離得到5個峰； （2）將上述各個峰分別作用于PC12細(xì)胞，結(jié)果顯示具有明顯神經(jīng)生長因子活性的是第Ⅲ峰。經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳方法對分離的神經(jīng)蛇毒生長因子進(jìn)行檢測為電泳純，其分子量經(jīng)計算得22.3KD； （3）MTT實驗結(jié)果表明蛇毒神經(jīng)生長因子對HSC-T6細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用：NGF濃度為1μg/ml時的抑制率為（25.1±2.1）%，濃度為5μg/ml時的抑制率為（48.2±1.9）%，明顯高于對照組的抑制率（23.8±1.8）%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）； （4）在流式細(xì)胞術(shù)實驗中通過檢測發(fā)現(xiàn)蛇毒生長因子能夠誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞發(fā)生凋亡：在NGF濃度為2μg/ml時的凋亡率為（16.16±3.02）%，5μg/ml時的凋亡率為（22.15±3.31）%，10μg/ml時的凋亡率為（31.28±2.16）%，明顯高于對照組的凋亡率（4.36±1.85）%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）； （5）空白對照組和被蛇毒NGF干預(yù)的雙向電泳圖譜經(jīng)比對分析后，共47個蛋白質(zhì)點有表達(dá)差異，有22個在蛇毒神經(jīng)生長因子干預(yù)組上表達(dá)增加，另有25個表達(dá)減少；隨著NGF濃度的變化，一些差異蛋白質(zhì)的表達(dá)也隨之變化； （6）對上述表達(dá)差異在1.8倍及以上的共18個蛋白質(zhì)點，，利用質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)進(jìn)行分析，鑒定出13個蛋白質(zhì)； （7）對這些差異蛋白質(zhì)利用生物信息學(xué)的手段進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞分化增殖、信號傳導(dǎo)通路、細(xì)胞氧化代謝、生物調(diào)節(jié)等過程起著十分重要的作用； （8）蛋白質(zhì)印記法結(jié)果顯示：TGF-β蛋白質(zhì)在對照組高表達(dá)，被NGF干預(yù)后，其表達(dá)能力隨著神經(jīng)生長因子濃度的增加而逐漸降低，呈負(fù)相關(guān)；與此同時，RHOA蛋白質(zhì)在神經(jīng)生長因子干預(yù)的條件下的表達(dá)增加，并且隨著神經(jīng)生長因子濃度的增大而逐漸增大，呈正相關(guān)。 結(jié)論: （1）具有生物活性的神經(jīng)生長因子能夠從眼鏡蛇毒中分離純化得到； （2）蛇毒神經(jīng)生長因子對HSC-T6細(xì)胞的增殖起到明顯的抑制作用； （3）蛇毒神經(jīng)生長因子對HSC-T6細(xì)胞的凋亡具有誘導(dǎo)作用； （4）蛇毒神經(jīng)生長因子能使HSC-T6細(xì)胞蛋白質(zhì)發(fā)生差異性表達(dá)； （5）發(fā)生差異性表達(dá)的蛋白質(zhì)應(yīng)該是在肝纖維化過程中的關(guān)鍵因素，這些蛋白質(zhì)能夠通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與生物調(diào)節(jié)，可能通過這種方式來實現(xiàn)抗肝纖維化的目的。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R575.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 潘頻華;黃四云;胡成平;;神經(jīng)生長因子誘導(dǎo)背根節(jié)感覺神經(jīng)元細(xì)胞iNOS和P物質(zhì)的表達(dá)及干擾素調(diào)節(jié)因子-1的作用(英文)[J];中南大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2011年05期

2 賴允麗;張學(xué)榮;張欽樂;胡仁統(tǒng);羅小玲;廖明;班建東;;眼鏡蛇毒神經(jīng)生長因子抑制肝星狀細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2012年06期

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4 劉成海,劉平,胡義揚,朱大元;丹酚酸B鹽對轉(zhuǎn)化生長因子-β1刺激肝星狀細(xì)胞活化與胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2002年18期

5 程明亮;細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與功能蛋白質(zhì)組學(xué)在肝纖維化發(fā)生機(jī)制研究中的新動向[J];中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志;2005年04期

本文編號：2406766