發(fā)布時間：2019-01-09 07:52

【摘要】：近年來，非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)發(fā)病率逐年升高，帶來的健康危害也越來越嚴重，已成為當今全球性的社會和醫(yī)學問題。國內(nèi)外眾多研究表明，NAFLD可以對除肝臟以外的系統(tǒng)，如腎臟、甲狀腺和心血管系統(tǒng)等產(chǎn)生影響，學者的既往研究主要集中于NAFLD與糖尿病、心臟病及慢性腎病之間的關聯(lián)及其相互作用機制，而對內(nèi)分泌系統(tǒng)影響的研究涉及不多。最新研究表明NAFLD容易導致性激素代謝紊亂，而性激素水平與生殖功能密切相關，但NAFLD是否影響生殖功能尚不得而知。因此，本研究重點探討NAFLD對男性生殖功能的影響及其潛在機制具有重要的臨床意義。 本研究第一部分采用現(xiàn)況調(diào)查的方法，以重慶市成年男性為研究對象，通過問卷調(diào)查和B超篩選出NAFLD人群，，檢測其性激素水平和精子質(zhì)量，評估NAFLD患者的生殖健康狀況。第二部分建立NAFLD雄性SD大鼠模型，檢測血清和睪丸中睪酮含量及精子質(zhì)量，并觀察睪丸組織形態(tài)學改變、生殖細胞分化、凋亡情況及雄鼠生育能力。第三部分選取睪酮合成關鍵酶基因信號通路為研究靶點，檢測StAR、P450scc、P45017α及AC-cAMP-PKA通路相關基因和蛋白的表達差異，初步探討NAFLD影響生殖功能的可能機制。本研究將為臨床采取科學、合理、有效的干預措施提供一定的理論依據(jù)。 研究內(nèi)容： 第一部分非酒精性脂肪性肝病男性患者生殖健康的流行病學調(diào)查 1.現(xiàn)況調(diào)查：本研究以重慶市城區(qū)為研究現(xiàn)場，隨機選取渝中區(qū)、江北區(qū)和涪陵區(qū)社區(qū)513名成年男性為研究對象，通過問卷調(diào)查收集人口學資料、生育情況、生活習慣和既往史等信息，并由大坪醫(yī)院消化內(nèi)科高資歷主治醫(yī)師對研究對象行男科體格檢查。所有研究對象均完成腹部彩色超聲檢查，根據(jù)2006年NAFLD診療指南中的B超診斷標準，將研究人群分為對照組、NAFLD組和NASH組。 2.生物標本采集分析：2013年6月抽取每名研究對象靜脈血10ml，檢測血常規(guī)、肝腎功、生化和血脂等，其中性激素檢測指標包括睪酮、雌激素(E2)、卵泡刺激素(FSH)、促黃體素(LH)、性激素結合球蛋白(SHBG)和抑制素B (INB)；同時收集精液和尿液，進行精子質(zhì)量分析和尿常規(guī)檢查，其中精子質(zhì)量檢測指標包括液化時間、體積、PH值、精子密度、精子活性和精子形態(tài)學，上述檢測均由大坪醫(yī)院檢驗科統(tǒng)一完成。 第二部分非酒精性脂肪性肝病對雄性SD大鼠生殖功能的影響 1.動物模型：5周齡SPF級雄性SD大鼠60只，隨機分為3組(每組20只)，即對照組(正常飲食12周)、NAFLD組(高脂飲食12周)和N-3治療組(高脂飲食12周，第9周開始N-3治療)。12周后，各組隨機選取大鼠10只處死，行各項指標的取材和檢測，每組剩余的10只雄鼠與雌性大鼠合籠1周(1：2)，記錄雌鼠妊娠情況，于妊娠第20d處死一半雌鼠，記錄吸收胎、死胎和活胎數(shù)，剩余雌鼠自然分娩，觀察F1代仔鼠1周的生長發(fā)育情況。 2.生殖指標的檢測：檢測大鼠血清性激素和睪丸中睪酮水平，采集一側附睪尾精子分析精子密度、精子活性和精子形態(tài)學的改變，并觀察睪丸組織形態(tài)學、生殖細胞分化和間質(zhì)細胞數(shù)量等指標，最后通過交配實驗觀察大鼠的F1代仔鼠生長發(fā)育情況。 第三部分非酒精性脂肪性肝病對雄性生殖損傷的機制探討 分別提取大鼠睪丸組織中的RNA和總蛋白。運用半定量RT-PCR法和Western blot法檢測睪酮合成通路中StAR、P450scc和P45017α等基因和蛋白的表達差異，并采用ELISA方法檢測AC活性和cAMP含量。 研究結果： 第一部分非酒精性脂肪性肝病男性患者生殖健康的流行學調(diào)查 1.人群特征：共招募513名志愿者，最終285名研究對象(55.6%)完成了整個研究的調(diào)查步驟，其中對照組103人，NAFLD組97人，NASH組85人。三組人群年齡、學歷、職業(yè)、婚姻狀況、收入水平、BMI、吸煙和飲酒等基本特征無統(tǒng)計學差異。NAFLD組和NASH組中WBC、RBC、HGB、HCT、TBIL、AST、ALT、GGT、CHOL、TG、CREA和URIC均顯著高于對照組，其他指標無統(tǒng)計學差異。 2．性激素水平：與對照組相比，在NASH組中，睪酮、LH和SHBG顯著下降，而FSH明顯升高；在NAFLD組中SHBG水平同樣低于對照組，而FSH水平也高于對照組(P0.05)，其他指標均無顯著性差異；NASH組與NAFLD組相比，LH和SHBG水平下降更為明顯。 3.精子質(zhì)量分析：NAFLD成年男性精子常規(guī)參數(shù)的均值：精液量，2.9mL；精子密度，65.3×106/mL；精子數(shù)，124.8×106；a級精子%，33.8%；(a+b)級精子%，53.1%；正常形態(tài)精子百分比，27.9%。其中精子密度、精子計數(shù)和精子活性均顯著低于對照組，其他指標均無統(tǒng)計學差異。 4.多因素分析：禁欲時間和NAFLD是精子參數(shù)的影響因素，隨著禁欲時間的延長，精液體積、精子密度和精子數(shù)有明顯上升；隨著肝臟脂肪含量的增加，精子密度、精子數(shù)和精子活性顯著降低。年齡、BMI、吸煙和飲酒對重慶市社區(qū)成年男性的精子參數(shù)無顯著影響。 第二部分非酒精性脂肪性肝病對雄性SD大鼠生殖功能的影響 1. NAFLD大鼠模型：NAFLD組大鼠外觀明顯肥胖，體重增加，肝臟顯著增大，HE和油紅O染色見大量脂滴沉積，隨造模時間延長，脂肪變程度逐漸加重，血清TC、TG、ALT在NAFLD組亦顯著升高。 2.激素水平和睪丸形態(tài)學：NAFLD組中血清睪酮、SHBG、LH和IGF-1水平顯著低于對照組，且睪丸中合成睪酮也明顯減少。NAFLD組中睪丸、附睪和前列腺等性腺器官臟器系數(shù)明顯降低，睪丸中曲細精管細胞層數(shù)減少，生精細胞出現(xiàn)大量脂滴，空泡化、細胞間隙增大，部分細胞從基膜脫落。 3.精子質(zhì)量分析：NAFLD組中精子數(shù)目和(a+b)級的精子所占百分比減少，而精子的畸形率無明顯變化。流式檢測發(fā)現(xiàn)，成熟的精子細胞減少，初級精母細胞減少，減數(shù)分裂減慢，NAFLD可能對精子細胞的早期分化產(chǎn)生影響。凋亡檢測提示NAFLD組中生殖細胞凋亡數(shù)目明顯增多，說明NAFLD可能影響生殖細胞的凋亡。 4.繁殖實驗：NAFLD雄鼠致雌鼠懷孕時間明顯延長，而懷孕率、活胎率、死胎率和吸收胎率均無顯著差異，說明NAFLD對雄鼠生育能力無不良影響。仔鼠出生存活率、出生體重、出生7天存活率和出生7天體重等指標表明F1代生長發(fā)育也未受明顯影響。 5. N-3PUFA治療作用：N-3PUFA治療4周后，NAFLD大鼠血清激素水平部分升高，睪丸中脂滴和空泡化數(shù)目也相對減少，精子數(shù)目和精子活性也有不同程度恢復，表明N-3PUFA對NAFLD誘導的大鼠生殖損傷具有一定保護作用。 第三部分非酒精性脂肪性肝病雄性生殖損傷的機制探討 1.睪酮合成限速酶：NAFLD可導致StAR、P450scc、17βHSD和P45017αmRNA和蛋白表達水平下降。NAFLD可顯著降低AC活性和cAMP含量，而對LHR mRNA和蛋白的表達水平無明顯影響，提示NAFLD是通過降低血清中LH的水平，減少LH與LHR的結合，進而影響AC-cAMP-PKA途徑，最終導致睪酮合成酶基因轉錄和表達水平降低。 2. N-3PUFA治療作用：經(jīng)過4周N-3PUFA治療，AC活性和cAMP含量均有不同程度的升高，而睪酮合成酶的表達水平無顯著變化，表明N-3PUFA可以部分恢復AC-cAMP-PKA途徑活性。 結論： 1.本研究首次檢測了我國男性NAFLD人群的精子質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)肝臟中脂肪含量的升高與性激素水平異常和精子質(zhì)量下降密切相關，并證實NAFLD是影響精子質(zhì)量的危險因素，需要引起人們的高度重視。 2. NAFLD誘發(fā)睪丸形態(tài)學改變，如細胞凋亡增加和間質(zhì)細胞減少，導致睪丸中睪酮合成減少而影響生殖功能，表現(xiàn)為精子數(shù)量和精子活性下降，而對精子形態(tài)和F1代的生長發(fā)育無影響。 3. NAFLD可導致血清中LH水平下降，減少LH與LHR的結合，進而抑制AC-cAMP-PKA通路，影響睪酮合成限速酶基因(StAR、P450scc、17βHSD和P45017α)的轉錄表達。 4.N-3PUFA對NAFLD誘導的生殖功能損傷具有一定的保護作用，并且也是通過激活AC-cAMP-PKA通路發(fā)揮作用，為臨床提高NAFLD患者的生活質(zhì)量提供實驗依據(jù)。 本研究結果顯示NAFLD對男性生殖功能有一定程度的影響，表現(xiàn)在精子數(shù)量和精子活性的下降，應加強對NAFLD防治，確保人民的生殖健康。同時發(fā)現(xiàn)NAFLD是通過抑制AC-cAMP-PKA通路，降低睪酮合成限速酶基因的轉錄表達，進而影響生殖功能，為臨床治療提供新的靶點，上述內(nèi)容經(jīng)過文獻檢索，國內(nèi)外尚未見類似的研究報道。 同時本研究也存在一些不足，如研究人群樣本量較小、依從性不高、均來源于社區(qū)，研究結果可能與NAFLD對普通人群生殖功能影響存在差異；對F1代的影響，只記錄了7天的生長發(fā)育情況，可能低估了NAFLD對下代的生長發(fā)育影響；在機制探討中，只檢測了LHRmRNA和蛋白水平及下游AC-cAMP系統(tǒng)的活性，并未直接檢測LH與LHR的結合情況，可能會影響到數(shù)據(jù)的完整性。 在今后的研究中，可以考慮深入探討NAFLD導致血清中LH水平下降的機制，如NAFLD對血清LH代謝情況或者對下丘腦-垂體-性腺軸調(diào)節(jié)；另外，還可在NAFLD動物模型的睪丸組織中，檢測線粒體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、脂肪酸代謝和糖代謝等通路的變化情況，進一步探索NAFLD影響男性生殖功能的分子機制。
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【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R575.5

【參考文獻】

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本文編號：2405338