發(fā)布時間：2019-01-07 12:31

【摘要】：背景： 慢性排斥反應(yīng)屬于遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng),一般發(fā)生在移植后半年或數(shù)年后,呈進(jìn)行性發(fā)展,其病因及機制錯綜復(fù)雜,不十分清楚,多由反復(fù)發(fā)作的急性排斥反應(yīng)所造成。慢性排斥反應(yīng)的病理特點為退行性及破壞性改變,表現(xiàn)為血管內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞、間質(zhì)纖維組織增生及單核巨噬細(xì)胞浸潤。慢性排斥反應(yīng)有一個共同組織學(xué)表現(xiàn)即移植物動脈硬化,移植物動脈硬化早期即有明顯的VSMC凋亡,并且VSMC凋亡與血管內(nèi)膜增厚、移植物動脈硬化相關(guān),其特征是泡沫細(xì)胞性閉塞性動脈病變,如動脈內(nèi)膜增厚、內(nèi)膜的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤及間質(zhì)纖維化。Mfn2基因,又稱為增殖抑制基因(HSG),它的表達(dá)產(chǎn)物抑制VSMC增殖的同時能誘導(dǎo)VSMC從處于增殖狀態(tài)的去分化型向分化型轉(zhuǎn)化,即HSG/Mfn2參與VSMC再分化過程。并且高表達(dá)的HSG/Mfn2基因能促進(jìn)大鼠的血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)的凋亡。但Mfn2在移植慢性排斥反應(yīng)中的功能及變化尚未有相關(guān)報道。 肝纖維化是指由于細(xì)胞外基質(zhì)的形成和降解的平衡失調(diào)導(dǎo)致肝內(nèi)纖維組織的積累,是許多纖維組織包圍的再生結(jié)節(jié)引起的肝臟結(jié)構(gòu)的廣泛破壞。肝纖維化是肝臟纖維結(jié)締組織的過度沉積,是纖維增生和纖維分解不平衡的結(jié)果。Mfn2作為一種新型的增殖抑制因子,已有研究表明其能抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖,減少血管內(nèi)膜彈性纖維組織的增多。同時,也已有相關(guān)文獻(xiàn)報道在糖尿病腎病模型中,Mfn2高表達(dá)可以抑制腎間質(zhì)纖維化,降低膠原4的表達(dá)。但是Mfn2對肝臟纖維化的影響尚未有相關(guān)報道。 目的： 本實驗擬通過研究Mfn2對大鼠腹主動脈移植慢性排斥反應(yīng)的影響以及在肝纖維化過程中的變化,探索Mfn2在纖維化過程中所起的作用以及可能的作用機制,為肝硬化的治療和移植術(shù)后降低慢性排斥反應(yīng)提供一定幫助。 方法： 1.構(gòu)建Mfn2-GFP漫病毒,并轉(zhuǎn)染供體Lewis大鼠移植段腹主動脈。 2.將轉(zhuǎn)染Mfn2-GFP的供體Lewis大鼠移植段腹主動脈移植到受體Bn大鼠的相應(yīng)位置腹主動脈段,并設(shè)立轉(zhuǎn)染GFP慢病毒的陰性對照組。 3.分別于30天、60天、90天取下移植段血管,用HE染色法和masson染色法觀察血管內(nèi)膜增厚程度。并采用免疫組化測定Mfn2和慢性排斥反應(yīng)相關(guān)因子TGF-β1、TGF-βR2的關(guān)系。 4.門靜脈注射Mfn2-GFP'慢病毒轉(zhuǎn)染大鼠肝臟,并通過CC14構(gòu)建大鼠肝硬化模型。 5.8周后取肝臟行HE和masson染色觀察肝臟形態(tài),并利用western、免疫組化等技術(shù)檢測其中Mfn2與纖維化相關(guān)因子TGF-β1、TGF-βR2、Smad3、Smad4、 Smad7、膠原Ⅳ、α-SMA的表達(dá)量關(guān)系。 6.用Mfn2慢病毒轉(zhuǎn)染大鼠肝星狀細(xì)胞,利用western檢測其中Mfn2與纖維化相關(guān)因子TGFβ1、TGFβR2、Smad3、Smad4、Smad7.膠原Ⅳ的相互關(guān)系。 7.CCK8、細(xì)胞凋亡、遷移實驗檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)Mfn2的肝星狀細(xì)胞的增殖情況。 結(jié)果： 1.通過masson染色和imagepro-plus6.0軟件測量移植段大鼠腹主動脈內(nèi)膜厚度,結(jié)果提示,移植后60天和90天,轉(zhuǎn)染Mfn2-GFP的腹主動脈內(nèi)膜厚度明顯小于轉(zhuǎn)染GFP的腹主動脈內(nèi)膜厚度(p0.001)。 2.免疫組化結(jié)果證實移植后60天和90天,轉(zhuǎn)染Mfn2-GFP的腹主動脈內(nèi)膜的TGF-β1、TGF-pR2的表達(dá)量要低于轉(zhuǎn)染GFP的腹主動脈內(nèi)膜(p0。01)。 3. Masson染色結(jié)果提示：行cc14造肝硬化模型時,2周即可出現(xiàn)明顯脂肪空泡,但肝臟結(jié)構(gòu)尚正常；4周時開始出現(xiàn)小葉內(nèi)變性、融合壞死,纖維間隔伴小葉結(jié)構(gòu)紊亂；6周出現(xiàn)較大范圍的橋接壞死,累及多個小葉,小葉結(jié)構(gòu)失常,纖維間隔小于O.1mm,但纖維結(jié)節(jié)直徑大于2mmm；8周出現(xiàn)較大范圍的橋接壞死,累及多個小葉,小葉結(jié)構(gòu)失常,纖維間隔小于0.1mm,但纖維結(jié)節(jié)直徑小于1mm。同時masson染色提示,門靜脈注射Mfn2-GFP'慢病毒的大鼠肝臟行ccl4造模8周后,纖維化程度與6周肝硬化模型無明顯差別(P0。05),低于8周肝硬化模型(P0.05)。 4.WB和免疫組化結(jié)果提示,肝硬化組Mfn2表達(dá)量小于對照陰性組和轉(zhuǎn)染Mfn2病毒組(p0.05),同時TGF-β1ΟTGF-βR2、Smad3、Smad4和膠原4表達(dá)量大于后兩者(p0.05),提示Mfn2有抑制肝纖維化作用,且有可能是通過參與TGFβ-Smad通路降低肝纖維化。 結(jié)論： 1.轉(zhuǎn)染Mfn2的移植段腹主動脈內(nèi)膜厚度明顯小于轉(zhuǎn)染GFP組,同時免疫組化提示前者TGFβ1和TGFβR2表達(dá)量皆小于后者,提示Mfn2可能通過調(diào)控TGFβ1降低移植物慢性排斥反應(yīng)。 2.Mfn2可以抑制肝纖維化過程,且有可能是通過參與TGFβ-Smad通路降低肝纖維化。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R575.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2403666