發(fā)布時(shí)間：2020-11-14 23:05

　　 目的:格子狀角膜營養(yǎng)不良(Lattice corneal dystrophy,LCD)是一種因轉(zhuǎn)化生長因子-β誘導(dǎo)基因(TGFBI)突變導(dǎo)致其基因產(chǎn)物蛋白(TGFBIp)淀粉樣變性的遺傳性疾病。變性的TGFBIp沉積于角膜基質(zhì)層,引起角膜結(jié)構(gòu)和功能損傷,造成視力障礙甚至完全喪失。因此,有效清除變性TGFBIp是LCD治療的關(guān)鍵。目前,阿爾茲海默病(AD)是淀粉樣變性蛋白所致疾病中研究最為深入的一種,AD患者大腦中的小膠質(zhì)細(xì)胞(一種巨噬細(xì)胞)可通過自噬降解淀粉樣變性蛋白。近年研究發(fā)現(xiàn),顆粒狀角膜營養(yǎng)不良(GCD)患者的角膜成纖維細(xì)胞中存在自噬清除變性TGFBIp的功能障礙。至今,還沒有任何關(guān)于巨噬細(xì)胞是否通過自噬降解LCD角膜變性蛋白的研究。因此,本研究旨在了解巨噬細(xì)胞是否通過自噬降解LCD的變性TGFBIp,同時(shí)了解這種變性蛋白質(zhì)降解與LCD發(fā)病的關(guān)系。方法:對海南省一LCD家系進(jìn)行遺傳病調(diào)查和研究。應(yīng)用裂隙燈顯微鏡觀察先證者和家系患病成員角膜,獲取先證者角膜進(jìn)行組織病理學(xué)染色;采取患者外周血提取DNA并測序檢測TGFBI基因所有17個(gè)外顯子,與基因庫數(shù)據(jù)比對以確定其基因型。對先證者角膜組織進(jìn)行熒光染色,觀察TGFBIp和CD11b的熒光分布關(guān)系。分離本家系患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC),用GM-CSF誘導(dǎo)為巨噬細(xì)胞后與基因重組野生型(正常)或突變型(變性)TGFBIp進(jìn)行共培養(yǎng),并進(jìn)行相應(yīng)的檢測和觀察。重組TGFBIp處理巨噬細(xì)胞5 h后,去除培養(yǎng)基中TGFBIp再繼續(xù)培養(yǎng)5 h,分別在0、2.5、5、7.5、10 h時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行檢測。Western blot(WB)檢測巨噬細(xì)胞內(nèi)TGFBIp含量、細(xì)胞CD36和CD68表達(dá)水平以及自噬相關(guān)分子LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、SQSTM1的表達(dá)水平;用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測培養(yǎng)基中TGFBIp濃度變化。對巨噬細(xì)胞進(jìn)行熒光染色,利用共聚焦顯微鏡觀察TGFBIp和CD11b的共定位以確定巨噬細(xì)胞與TGFBIp的關(guān)系;觀察內(nèi)源性LC3斑點(diǎn)和TGFBIp的共定位情況,同時(shí)也觀察內(nèi)源性LC3斑點(diǎn)和LAMP1的共定位情況以確定自噬及其完整性。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測巨噬細(xì)胞CD36和CD68在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)水平。結(jié)果:本研究所調(diào)查的LCD家系共有25名成員,其中14人被確診LCD�；�因測序發(fā)現(xiàn)所有患者都存在TGFBI基因的點(diǎn)突變,即1673位點(diǎn)堿基T替換為C(c.1673 TC),導(dǎo)致TGFBIp 558位點(diǎn)的亮氨酸替換為脯氨酸(p.Leu558Pro)。在病變角膜組織中發(fā)現(xiàn)明顯的TGFBIp聚集和巨噬細(xì)胞浸潤�；颊邅碓吹木奘杉�(xì)胞對WT TGFBIp和MU TGFBIp均有相似的初始內(nèi)吞能力,在外源性TGFBIp存在的情況下細(xì)胞內(nèi)TGFBIp含量相似,但外源性TGFBIp去除后,MU TGFBIp處理的巨噬細(xì)胞內(nèi)仍有較高濃度的MU TGFBIp,相反WT TGFBIp處理的巨噬細(xì)胞內(nèi)WT TGFBIp則基本檢測不到;使用抑制劑3-MA或leupeptin后,巨噬細(xì)胞中的WT TGFBIp與MU TGFBIp含量在各時(shí)間點(diǎn)均相似,而在MG132作用下無此現(xiàn)象。WT TGFBIp處理的巨噬細(xì)胞發(fā)現(xiàn)有CD36和CD68高表達(dá),而MU TGFBIp處理的巨噬細(xì)胞的表達(dá)變化則不明顯。用WB檢測自噬相關(guān)分子LC3-Ⅱ發(fā)現(xiàn),WT TGFBIp和MU TGFBIp處理的巨噬細(xì)胞中均有LC3-Ⅱ的顯著高表達(dá);但在TGFBIp去除后,MU TGFBIp處理巨噬細(xì)胞的LC3-Ⅱ高表達(dá)仍穩(wěn)定保持,而WT TGFBIp處理巨噬細(xì)胞的LC3-Ⅱ則基本恢復(fù)至未接觸TGFBIp時(shí)的基礎(chǔ)水平。共聚焦顯微鏡觀察到的LC3與TGFBIp共定位情況也與以上WB檢測結(jié)果類似。此外,用WB檢測還發(fā)現(xiàn),WT TGFBIp處理的巨噬細(xì)胞中SQSTM1含量明顯下降,但在MU TGFBIp處理的巨噬細(xì)胞中SQSTM1則保持含量不變;共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),WT TGFBIp處理的巨噬細(xì)胞中有明顯的LC3和LAMP1共定位。此外,3-MA阻斷自噬后,用WB和流式細(xì)胞術(shù)檢測CD68和CD36表達(dá),發(fā)現(xiàn)這兩種分子的表達(dá)與未阻斷前有明顯不同,即WT TGFBIp和3-MA處理的巨噬細(xì)胞中這兩種分子表達(dá)水平均顯著下降,并與單純MU TGFBIp處理的巨噬細(xì)胞表達(dá)水平相似。結(jié)論:以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,本家系TGFBI基因突變?yōu)閏.1673 TC,引起蛋白變性(p.Leu558Pro);變性的TGFBIp沉積于角膜是導(dǎo)致LCD病變的一種重要原因;巨噬細(xì)胞自噬降解變性TGFBIp的過程中出現(xiàn)自噬流不完整,表現(xiàn)為自噬小體不能有效形成自噬溶酶體;巨噬細(xì)胞對變性TGFBIp的不完整自噬不僅造成變性TGFBIp的降解失常,同時(shí)還降低巨噬細(xì)胞的吞噬活性,從而降低巨噬細(xì)胞對TGFBIp持續(xù)性內(nèi)吞和降解清除的能力,加重變性TGFBIp在角膜部位的沉積聚集。因此,設(shè)法恢復(fù)巨噬細(xì)胞對變性TGFBIp的完整自噬和有效降解有可能成為LCD治療的新策略。
【學(xué)位單位】：海南醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R772.2
【部分圖文】：

圖 1. 本研究格子狀角膜營養(yǎng)不良家系圖譜。實(shí)心和空心圖標(biāo)分別表示患病和患病者。箭頭代表先證者。Figure 1. Pedigree of family with lattice corneal dystrophy. Filled and open symrepresent affected and unaffected individuals, respectively. Arrowhead indicatesproband.對先證者的 27 歲女兒（圖 1，Ⅲ-5）進(jìn)行裂隙燈顯微鏡檢查，發(fā)現(xiàn)了在大

.（A）先證者女兒（Ⅲ-5）裂隙燈顯微鏡檢查圖片；（B）先證者角膜組檢查（剛果紅染色）re 2. (A) Slit lamp photomicrographs of the daughter of proband (III-5opathological examination of the cornea from the proband displays poing with Congo red.

導(dǎo)致蛋白質(zhì) 558 位點(diǎn)亮氨酸被替換為脯氨酸（p.Leu558Pro，圖 3）圖 2.（A）先證者女兒（Ⅲ-5）裂隙燈顯微鏡檢查圖片；（B）先證者角膜組理學(xué)檢查（剛果紅染色）Figure 2. (A) Slit lamp photomicrographs of the daughter of proband (III-5Histopathological examination of the cornea from the proband displays postaining with Congo red.
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本文編號：2884051