GAP-43基因修飾干細(xì)胞對(duì)視網(wǎng)膜色素變性保護(hù)性研究
發(fā)布時(shí)間:2018-12-18 07:14
【摘要】:前言: 視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa,RP)是一種遺傳性進(jìn)行性視網(wǎng)膜退行性病變,在視網(wǎng)膜變性類疾病中,具有典型的代表性。RP國際發(fā)病率為1/3500~1/4000,好發(fā)于青壯年。目前認(rèn)為該病的發(fā)生是由于視網(wǎng)膜色素上皮(retinalpigment epithelium,RPE)對(duì)光感受器細(xì)胞脫落的外節(jié)膜盤吞噬功能下降,致使其在視網(wǎng)膜外層堆積,光感受器細(xì)胞外節(jié)段結(jié)構(gòu)紊亂,最終至光感受器細(xì)胞變性死亡。現(xiàn)階段治療RP已嘗試多種方式,包括細(xì)胞移植治療、基因治療、細(xì)胞因子治療、營養(yǎng)因子治療]和高壓氧治療等。 近年來,細(xì)胞移植療法和基因療法在治療視網(wǎng)膜色素變性中取得了較大進(jìn)展;虔煼ㄍㄟ^高表達(dá)神經(jīng)營養(yǎng)因子基因或抗凋亡基因,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)或抗凋亡作用。在細(xì)胞移植療法中,移植細(xì)胞替代已經(jīng)凋亡的細(xì)胞,也可通過分泌生長因子保護(hù)視網(wǎng)膜細(xì)胞。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)在細(xì)胞移植療法中具有廣闊的應(yīng)用前景,同時(shí)還是一種良好的載體,可介導(dǎo)外源基因穩(wěn)定表達(dá)。因此將基因治療及細(xì)胞治療結(jié)合在一起,對(duì)BMSCs進(jìn)行基因修飾后再移植到患者體內(nèi),既可以表達(dá)外源目的基因,也可同時(shí)發(fā)揮自身的營養(yǎng)保護(hù)及分化作用,理論上對(duì)治療變性視網(wǎng)膜疾病具有重要探索意義。 視網(wǎng)膜的神經(jīng)上皮層是由6種神經(jīng)元細(xì)胞組成。分別為:視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞,專司感光;雙極細(xì)胞,約有10到數(shù)百個(gè)光感受器細(xì)胞通過雙極細(xì)胞與一個(gè)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞相聯(lián)系,起到聯(lián)絡(luò)作用;視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cell,RGC),負(fù)責(zé)傳導(dǎo)視覺信號(hào);水平細(xì)胞和無長突細(xì)胞,負(fù)責(zé)視覺信息橫向聯(lián)系。故RP中視網(wǎng)膜細(xì)胞變性死亡,其本質(zhì)為神經(jīng)元結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生變化,最終變性凋亡。 GAP-43(growth-associated protein-43)是一種神經(jīng)生長的相關(guān)蛋白,與神經(jīng)發(fā)育和再生密切相關(guān)。我們之前利用抑制性消減雜交技術(shù)(suppression subtractivehybridization,SSH)篩選出差異表達(dá)基因GAP-43,發(fā)現(xiàn)GAP-43基因在BMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化過程中起著重要作用。GAP-43基因?qū)朐鶥MSCs內(nèi)后,體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)了該基因?qū)τ贐MSCs向視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞方向分化具有明顯的促進(jìn)作用。 皇家外科學(xué)院大鼠(Royal College of Surgeons rat,RCS rat)是遺傳性RP典型動(dòng)物模型,本實(shí)驗(yàn)將經(jīng)GAP-43基因修飾的BMSCs移植入RCS大鼠眼中,探討在不同微環(huán)境下,GAP-43基因修飾的BMSCs分化情況;同時(shí)在細(xì)胞形態(tài)和功能角度上觀察移植后對(duì)視網(wǎng)膜各層細(xì)胞產(chǎn)生的影響,特別是對(duì)視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞的保護(hù)作用,探討視網(wǎng)膜色素變性新的治療途徑。 目的: 探討GAP-43基因修飾的BMSCs對(duì)RCS大鼠視網(wǎng)膜保護(hù)作用。 方法: 利用單純貼壁法在體外分離、培養(yǎng)SD大鼠BMSCs,經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)鑒定,得到狀態(tài)穩(wěn)定的BMSCs。構(gòu)建慢病毒介導(dǎo)的GAP-43高表達(dá)載體(LV5-GAP),感染BMSCs后,得到GAP-43基因修飾的BMSCs(BMSCs-LV5-GAP-43)。將67只出生21天(P21)的雄性RCS大鼠隨機(jī)分為三組:BMSCs+GAP-43組、BMSCs組和NC組。BMSCs+GAP-43組是將5×104/2ul GAP-43基因修飾的BMSCs的細(xì)胞懸液注射到RCS大鼠視網(wǎng)膜下;BMSCs組注射5×104/2ul BMSCs細(xì)胞懸液;NC組大鼠則僅將2ul PBS注射入視網(wǎng)膜下。應(yīng)用免疫熒光,Western Blot免疫印跡法檢測GAP-43、谷氨酰胺合成酶(Glutaminesynthetase,GS)和視紫紅質(zhì)(rhodopsin,Rho)表達(dá)水平。利用HE染色評(píng)估視網(wǎng)膜外核層(outer nuclear layer,ONL)厚度。應(yīng)用原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotinnick end labeling assay,TUNEL assay)評(píng)估視網(wǎng)膜神經(jīng)元凋亡情況。應(yīng)用WesternBlot免疫印跡法檢測外源性凋亡通路介導(dǎo)因子Caspase-8和內(nèi)源性凋亡通路介導(dǎo)因子Caspase-9的表達(dá)量,闡明GAP-43在視網(wǎng)膜色素變性中抗凋亡的途徑及機(jī)制。 結(jié)果: (1)體外分離培養(yǎng)的BMSCs可穩(wěn)定傳代,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞抗原:CD90和CD44表達(dá)陽性,CD11b和CD45表達(dá)陰性;GAP-43基因序列經(jīng)酶切、轉(zhuǎn)化、包裝和轉(zhuǎn)染得到慢病毒載體LV5-GAP;感染BMSCs后,Western Blot及細(xì)胞免疫熒光檢測GAP-43在BMSCs-LV5-GAP-43中表達(dá)量升高(P<0.05);將細(xì)胞移植到視網(wǎng)膜下腔后,Western Blot顯示, BMSCs+GAP-43組RCS大鼠視網(wǎng)膜下細(xì)胞移植后GAP-43表達(dá)顯著增加(P<0.05); (2)Western Blot及免疫熒光檢測顯示,Rho在BMSCs+GAP-43組表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05),但BMSCs組與BMSCs+GAP-43組相比,GS在BMSCs組顯著上調(diào)(P<0.05);組織學(xué)分析顯示, BMSCs+GAP-43組ONL高度明顯大于其他兩組(P 0.05); (3)細(xì)胞注射到視網(wǎng)膜下30天后,TUNEL檢測顯示, BMSCs+GAP-43組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量與其他組相比明顯減少(P0.05); (4)Western Blot免疫印跡法顯示,Caspase-8和Caspase-9在BMSCs+GAP-43組被顯著下調(diào)(P0.05)。 結(jié)論: (1)本研究成功分離、培養(yǎng)出大鼠BMSCs,,并構(gòu)建了穩(wěn)定攜帶GAP-43基因的慢病毒載體;感染BMSCs后能穩(wěn)定、持久的表達(dá)GAP-43蛋白,移植BMSCs-LV5-GAP-43到RCS大鼠視網(wǎng)膜下腔,發(fā)現(xiàn)BMSCs在變性視網(wǎng)膜環(huán)境中逐漸消失,但是GAP-43表達(dá)量逐漸升高。 (2)BMSCs-LV5-GAP-43移植到視網(wǎng)膜下腔,能減輕Müller細(xì)胞增殖作用,防止產(chǎn)生“膠質(zhì)封閉”;BMSCs-LV5-GAP-43能保護(hù)光感受器細(xì)胞,維持視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性。 (3)采用TUNEL方法檢測到凋亡細(xì)胞主要集中在ONL,BMSCs-LV5-GAP-43移植后通過抗凋亡作用保護(hù)光感受器細(xì)胞,并且阻斷由Caspase-9和Caspase-8介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)外源凋亡途徑,抑制神經(jīng)元凋亡,維持視網(wǎng)膜外核層完整性。 (4)GAP-43基因修飾的BMSCs在RCS視網(wǎng)膜變性的2個(gè)月內(nèi),對(duì)RP視網(wǎng)膜有保護(hù)及抗凋亡作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】:吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】:博士
【學(xué)位授予年份】:2015
【分類號(hào)】:R774.1
本文編號(hào):2385540
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】:吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】:博士
【學(xué)位授予年份】:2015
【分類號(hào)】:R774.1
【參考文獻(xiàn)】
相關(guān)期刊論文 前3條
1 霍冬梅;董方田;于偉泓;高斐;;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在視網(wǎng)膜色素變性大鼠視網(wǎng)膜下的分化(英文)[J];國際眼科雜志;2010年10期
2 劉斌,唐軍民,朱秀安,唐巖;RCS大鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的凋亡[J];解剖學(xué)報(bào);1998年04期
3 李躍萍;宋麗萍;邱曙東;;慢病毒載體在腫瘤基因治療中的應(yīng)用[J];現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué);2006年12期
本文編號(hào):2385540
本文鏈接:http://www.lk138.cn/yixuelunwen/wuguanyixuelunwen/2385540.html
最近更新
教材專著