發(fā)布時間：2020-11-06 15:45

　　 研究背景:近幾十年來,全球范圍內(nèi)男性的生育能力呈現(xiàn)出顯著下降的趨勢。大量臨床流行病學(xué)和動物實驗研究發(fā)現(xiàn),高脂攝入與男性生育能力呈顯著負(fù)性相關(guān)。精子質(zhì)量下降是男性不育的最主要原因之一。精子形成過程錯綜復(fù)雜,是多種睪丸細(xì)胞復(fù)雜而精細(xì)的相互作用結(jié)果。其中睪丸支持細(xì)胞,作為生精細(xì)胞的“保姆”細(xì)胞,在精子的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮十分重要的作用。支持細(xì)胞為生精細(xì)胞提供物理和免疫屏障、依附支撐、營養(yǎng)支持等作用。支持細(xì)胞為生精細(xì)胞提供多種營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物(碳水化合物,氨基酸,脂質(zhì)等)作其能量來源,其中乳酸尤為重要。乳酸不僅是發(fā)育中的生精細(xì)胞的主要能源底物,同時還可以保護(hù)生精細(xì)胞,減少生精細(xì)胞的凋亡。研究表明,2,4-二氯苯氧乙酸和雙酚A等一些化學(xué)物質(zhì)可以通過抑制支持細(xì)胞乳酸的產(chǎn)生,降低精子質(zhì)量,進(jìn)而損傷雄性生育能力。另有研究發(fā)現(xiàn)支持細(xì)胞可以通過增加乳酸生成,從而減少由熱應(yīng)激引起的生精細(xì)胞的凋亡。目前研究發(fā)現(xiàn),高脂飲食可以通過破壞支持細(xì)胞血睪屏障的完整性,影響精子密度和精子能動性,降低雄性生育能力。高脂飲食是否通過調(diào)控睪丸支持細(xì)胞營養(yǎng)代謝,影響精子質(zhì)量,從而損傷雄性生育能力,目前尚不清楚。目的:探討高脂飲食是否通過調(diào)節(jié)睪丸支持細(xì)胞糖代謝進(jìn)而影響男性生育能力,以及導(dǎo)致支持細(xì)胞糖代謝變化的潛在機制。方法:3周雄性Wistar大鼠,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機分為兩組:分別給予普通飼料(普食組)和高甘油三酯飼料(高脂組)喂養(yǎng),建立高脂攝入大鼠模型。每周稱量體重,飼養(yǎng)8周后(即鼠齡12周),按1:2的比例與12周Wistar雌鼠合籠5天,評估兩組雌鼠懷孕率和幼崽數(shù)目。處死雄鼠,(1)采用全自動生化分析儀檢測血清甘油三酯(TG),總膽固醇(TC),低密度脂蛋白(LDL-C),高密度脂蛋白(HDL-C)及血糖水平。(2)計算機輔助精子質(zhì)量分析檢測附睪尾的精子數(shù)目、精子密度,精子活力,精子能動性等指標(biāo)。(3)利用HE染色、電鏡觀察:睪丸及支持細(xì)胞的大體形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)變化,利用油紅0染色觀察睪丸內(nèi)脂質(zhì)沉積情況。(4)利用乳酸檢測試劑盒測定睪丸組織乳酸水平的變化。從19-20天的Wistar雄鼠睪丸獲取原代支持細(xì)胞,免疫熒光檢測支持細(xì)胞核特異性表達(dá)WT1蛋白進(jìn)行細(xì)胞純度鑒定,CCK8篩選棕櫚酸處理濃度及時間。給予0、0.25、0.50mmol/L棕櫚酸處理24h后,觀察:(1)油紅0評估支持細(xì)胞的脂質(zhì)含量。(2)GOD-POD法評估葡萄糖消耗情況;試劑盒測定支持細(xì)胞乳酸合成和分泌情況和細(xì)胞內(nèi)丙酮酸及丙酮酸其他代謝產(chǎn)物水平。(3)利用細(xì)胞能量分析儀檢測棕櫚酸對支持細(xì)胞糖酵解及乳酸合成的影響。(4)利用Western blot檢測糖代謝關(guān)鍵指標(biāo)的蛋白表達(dá)。結(jié)果:1.高脂飲食的大鼠體重增加,血脂升高;大鼠的精子密度下降(P0.05),配對雌鼠平均每窩產(chǎn)仔數(shù)下降達(dá)40%(12.33±0.33 vs 7.33±1.20,P0.05);2.高脂攝入導(dǎo)致睪丸生精上皮變薄紊亂,支持細(xì)胞胞漿中空泡數(shù)量的增加,電鏡觀察支持細(xì)胞發(fā)現(xiàn)高脂攝入大鼠支持細(xì)胞的正常線粒體數(shù)目減少,同時自噬線粒體數(shù)目增加,支持細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)異常;3.高脂飲食大鼠的生精小管和支持細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)顯著的脂質(zhì)沉積,棕櫚酸刺激的支持細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積也顯著多,棕櫚酸0.50mmol/L組細(xì)胞比0.25mmol/L組細(xì)胞更加明顯;4.高脂增加支持細(xì)胞糖酵解水平,促進(jìn)乳酸合成。高脂飲食大鼠睪丸組織乳酸水平顯著高于普通飲食大鼠(32.97±1.119 vs 37.60±1.391,P0.05);棕櫚酸處理后的支持細(xì)胞分泌到培養(yǎng)基中的乳酸明顯增加,尤其是在0.50mmol/L棕櫚酸處理的細(xì)胞中(10.03±0.37 vs 16.61 ±1.27,P0.01);5.棕櫚酸處理支持細(xì)胞后,葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1表達(dá)沒有明顯變化,而棕櫚酸0.50mmol/L組的支持細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白3表達(dá)增加(對照組的1.38±0.14倍,P0.05);細(xì)胞內(nèi)乳酸脫氫酶蛋白質(zhì)表達(dá)和活性沒有明顯變化,但棕櫚酸0.50mmol/L組的細(xì)胞培養(yǎng)基中乳酸脫氫酶活性顯著增加(33.17±4.15 vs 56.36 ± 1.88,P0.05);單羧酸轉(zhuǎn)運體4蛋白表達(dá)增加(P0.05)。結(jié)論:高脂飲食促進(jìn)睪丸支持細(xì)胞糖酵解和乳酸合成,可能是在高脂條件下支持細(xì)胞維持生精細(xì)胞正常發(fā)育的一種保護(hù)性的行為。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R698.2
【部分圖文】：

Ｗｉｓｔａｒ大鼠，喂食期間連續(xù)８周每周監(jiān)測大鼠體重，處死前評估大鼠的一般情??況和生殖能力。在第８周末處死后大鼠，獲得大鼠的附睪脂肪重量，睪丸系數(shù)和??血脂血糖等參數(shù)。如圖１Ａ，１Ｄ所示，從第３周開始，高脂飲食大鼠的體重顯著??高于喂食正常飼料的年齡匹配的同窩大鼠，一直持續(xù)到喂養(yǎng)第８周（Ｐ＜０．?０５）。??與普通飲食大鼠相比，高脂飲食大鼠的附睪脂肪顯著增加（２．?４３±０．?１８?ｖｓ??４．?９±０．?５２，圖ＩＢ，?Ｄ，Ｐ＜０．?０１），睪丸重量無明顯變化，但睪丸系數(shù)降低（圖１Ｃ，?Ｄ，??Ｐ＜０．０５）。??Ａ，一?．?．?％?Ｃ?６１??＾?｜：?Ｉ?Ｉ?（Ｉ??。。２?ｉ，，ｆ?６?８?摩?秦??Ｄ?Ｅ?Ｆ??ＮＤ?ＨＦＤ?：ｊＮＤ?Ｊ＾ＦＤ?’?■囊食?１５??圖１高脂和普通飲食大鼠的一般特點??＇Ａ．大鼠體重；Ｂ．大鼠附睪脂肪重量；Ｃ．大鼠睪丸系數(shù)；Ｄ．大鼠、附睪脂肪及附睪的代表性??照片；Ｅ．大鼠血脂水平，甘油三酯（ＴＧ），總膽固醇（ＴＣ），低密度脂蛋白（ＬＤＬ－Ｃ），高密度脂蛋??白（ＨＤＬ－Ｃ），?＊Ｐ＜０．

為進(jìn)一步評估高脂攝入對雄性生育能力的影響，本課題在處死大鼠前１周使??每只雄鼠與同齡的兩只雌鼠配對交配，連續(xù)５天，觀察配對雌鼠的懷孕及產(chǎn)仔情??況，處死大鼠后立即比較了兩組大鼠精子質(zhì)量。如圖２Ａ所示，兩組大鼠配對的??雌性大鼠的生育率沒有差異。然而，與普通飲食組配對雌鼠相比較，與高脂飲食??大鼠交配的雌鼠每窩產(chǎn)仔數(shù)顯著下降約４０％?（１２．?３３土０．３３?ｖｓ?７．?３３３土?１．２０，??圖２Ｂ，Ｐ＜０．?０５）。計算機輔助精子分析顯示，與普通飲食大鼠相比，高脂飲食大??鼠的精子密度顯著下降（Ｐ＜〇．?〇１），精子活力和前向運動的精子百分比略有下降??（圖２Ｃ）。說明高脂攝入導(dǎo)致雄性精子質(zhì)量下降及生育能力降低。??Ａ?Ｂ?１５?Ｃ，５?■麵飲食??１．５］?１５１?？■高脂飲食??ｉ：ｉｉ?Ｉ：｜ｉ?�。海椋�ｔ??。。｜｜?＇ｌｌ！?＇。亂ＩＪＩ??翁，／?ｉｆ?０?／??圖２兩組雄性大鼠的生育能力與精子質(zhì)量??Ａ．配對雌鼠懷孕率；Ｂ？配對雌鼠平均每窩產(chǎn)仔數(shù)目；Ｃ．大鼠的精子質(zhì)量，包括精子密度，精??子能動性

色檢測分析高脂攝入對睪丸組織脂質(zhì)含量的影響，發(fā)現(xiàn)對于普通飲食和高脂飲食??大鼠的同一周期的生精上皮，高脂攝入顯著增加了生精小管和支持細(xì)胞中的脂質(zhì)??積聚（圖３Ａ，Ｂ）。??Ａ?普通飲食?高脂飲食?Ｂ?ｎｔ．??．?｜?〇－］?ｔ??：?，．：’二‘＇?Ｉ?０．３．?丄??．?＿?？?１?０．２－??８?〇１．ｉ｜??ｇ?■??一?＞－－－ＶＶ－．?ｉ１〇〇－ｐｍ?＇１〇〇ｐｍ?－?°＇°?吟冷??圖３兩組大鼠睪丸冰凍組織油紅０染色??Ａ．大鼠睪丸冰凍組織油紅０染色；Ｂ？油紅０面積。標(biāo)尺，１００?Ｍ?ｍ。＊Ｐ＜０＿?０５。??２．２高脂攝入破壞大鼠睪丸組織形態(tài)和支持細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)??為明確高脂攝入是否損傷生精小管及支持細(xì)胞結(jié)構(gòu)，本課題利用Ｈ＆Ｅ染色??和透射電子顯微鏡（ＴＥＭ）技術(shù)來分析兩組大鼠的睪丸組織形態(tài)和支持細(xì)胞超微??結(jié)構(gòu)的改變。如圖４Ａ的Ｈ＆Ｅ結(jié)果顯示，與普通飲食組相比，高脂飲食對睪丸生??精小管的數(shù)量沒有明顯影響，然而在高脂飲食大鼠中，睪丸生精上皮略微變薄和??紊亂，伴隨著支持細(xì)胞胞漿中空泡數(shù)量的增加。進(jìn)一步利用電鏡觀察支持細(xì)胞發(fā)??現(xiàn)，與普通飲食組相比，高脂飲食大鼠支持細(xì)胞的正常線粒體數(shù)目減少，同時自??噬線粒體數(shù)目增加。另外
【參考文獻(xiàn)】

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1 黃巍;黃紅梅;王紅;趙吉存;李勉洲;王洪強;王新生;王沛濤;;雙酚A對大鼠睪丸支持細(xì)胞糖代謝的影響[J];中華男科學(xué)雜志;2015年02期

本文編號：2873329