發(fā)布時(shí)間：2020-10-26 23:00

　　 研究背景及目的膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中常見(jiàn)的腫瘤,世界范圍內(nèi),膀胱癌最常見(jiàn)的組織學(xué)類型是移行細(xì)胞癌,占膀胱癌總數(shù)的90%,約75%的初發(fā)者為淺表性膀胱移行細(xì)胞癌。其傳統(tǒng)的治療方法是經(jīng)尿道切除病變,然后膀胱內(nèi)注入化療藥物。由于膀胱癌具有易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及耐藥等生物學(xué)特性,因此長(zhǎng)期進(jìn)行膀胱灌注化療的患者,易對(duì)藥物產(chǎn)生抵抗,進(jìn)而加速腫瘤的惡化,導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡。故闡明膀胱癌的耐藥機(jī)制,以期逆轉(zhuǎn)耐藥成為膀胱癌臨床治療的關(guān)鍵問(wèn)題。目前對(duì)于耐藥機(jī)制的研究大多基于編碼基因到蛋白質(zhì)層面,并不能很好的解釋腫瘤耐藥問(wèn)題。隨著表觀遺傳學(xué)研究的不斷深入,非編碼RNA在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域引起越來(lái)越多的關(guān)注。已有相關(guān)研究表明非編碼 RNA(non-coding RNAs,ncRNAs),如小 RNA(micro RNA,miRNAs)、長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long-noncoding RNAs,lnc RNAs)等均參與介導(dǎo)腫瘤耐藥的發(fā)生。然而關(guān)于lnc RNAs參與調(diào)控人膀胱癌耐藥的機(jī)制尚未闡明。為探討lnc RNAs參與人膀胱癌耐藥的具體機(jī)制,本研究擬:①構(gòu)建膀胱癌T24多柔比星耐藥株,驗(yàn)證耐藥性,初步探討耐藥機(jī)制;②高通量測(cè)序、生物信息學(xué)分析篩選親本株與耐藥株差異表達(dá)的lnc RNAs。研究方法采用體外大濃度多柔比星(Doxorubicn,DOX)結(jié)合時(shí)間遞增沖擊誘導(dǎo)構(gòu)建人膀胱癌多柔比星耐藥細(xì)胞株T24/DOX;倒置顯微鏡下觀察不同階段親本株T24、耐藥株T24/DOX細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變;CCK-8法檢測(cè)不同階段親本株T24、耐藥株T24/DOX的IC50,計(jì)算耐藥指數(shù)(RestitanceIndex,RI);分別繪制親本株T24、耐藥株T24/DOX生長(zhǎng)曲線、計(jì)算倍增時(shí)間,初步衡量T24/DOX細(xì)胞耐藥性;平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)T24親本株和T24/DOX耐藥株的單細(xì)胞克隆形成能力;羅丹明123(Rh123)蓄積實(shí)驗(yàn)檢測(cè)T24親本株和T24/DOX耐藥株細(xì)胞內(nèi)羅丹明蓄積量,檢測(cè)耐藥相關(guān)蛋白P-gp的活性;PI/Hoechst33342雙染檢測(cè)T24親本株和T24/DOX耐藥株在不同藥物濃度下的細(xì)胞凋亡率;Western Blot檢測(cè)T24親本株和T24/DOX耐藥株細(xì)胞內(nèi)耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá),初步探索T24/DOX耐藥機(jī)制;采用皮下移植瘤法建立T24親本株、T24/DOX耐藥株的裸鼠移植瘤耐藥模型,在體驗(yàn)證T24/DOX耐藥性及其機(jī)制;高通量測(cè)序篩選T24親本株和T24/DOX耐藥株差異表達(dá)的lnc RNA。研究結(jié)果1.T24/DOX耐藥細(xì)胞株建立:成功建立了人膀胱癌T24/DOX耐藥細(xì)胞株(耐藥株與親本株同源);親本株T24和耐藥株T24/DOX的IC50值分別為247.6 ng/ml、3221 ng/ml,RI 為 13.01。2.耐藥性的驗(yàn)證:倒置顯微鏡下可觀察到耐藥株T24/DOX較親本株T24細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯改變,變形細(xì)胞比例增大;細(xì)胞生長(zhǎng)曲線顯示,親本株T24和耐藥株T24/DOX細(xì)胞的倍增時(shí)間分別為(53.41 ± 8.24)h和(44.36 ± 6.64)h,即與親本株T24相比,T24/DOX耐藥細(xì)胞株的倍增時(shí)間延長(zhǎng)(P0.05)。親本株T24和耐藥株T24/DOX細(xì)胞克隆形成率分別為(18.4±1.83)%和(44.93±3.03)%,與T24細(xì)胞相比,T24/DOX克隆形成率明顯增多(P0.01);Rh123蓄積實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與T24細(xì)胞(6.43±0.75%)相比,T24/DOX耐藥細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度明顯減弱,陽(yáng)性細(xì)胞率也明顯減少(2.15±0.81)%(P0.01);PI/Hoechst33342染色結(jié)果顯示在不同的藥物濃度(DOX 2.5、1.25、0.625 μg/ml)作用下,與T24細(xì)胞相比,T24/DOX紅色熒光均減少(P0.05);成功建立裸鼠移植瘤體內(nèi)耐藥模型,成瘤率大于90%。T24裸鼠移植瘤抑瘤率為76.18%,T24/DOX裸鼠移植瘤抑瘤率為32.23%(P0.05)在體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)T24/DOX具有明顯的耐藥性。3.T24親本株與T24/DOX耐藥株中耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá):與T24細(xì)胞相比,T24/DOX耐藥細(xì)胞株中Bcl-2表達(dá)量升高,Bax/Bcl-2比率顯著降低(P0.05),P-gp蛋白表達(dá)量升高(P0.01),caspase-3的表達(dá)降低(P0.05);裸鼠移植瘤組織中蛋白表達(dá),在對(duì)照組中與T24裸鼠移植瘤相比,T24/DOX組Bcl-2表達(dá)量升高,Bax表達(dá)量降低,Bax/Bcl-2比值降低(P0.01),Caspase-3的表達(dá)降低(P0.01);在給藥組中與DOXT24裸鼠移植瘤相比,組Bcl-2表達(dá)量升高,Bax表達(dá)量降低,Bax/Bcl-2比值降低(P0.05),Caspase-3的表達(dá)降低(P0.05),裸鼠瘤組織中蛋白表達(dá)情況與細(xì)胞中表達(dá)情況一致。4.高通量測(cè)序結(jié)果:分別對(duì)T24、T24/DOX(RI分別為6.12和13.01)三株細(xì)胞進(jìn)行高通量測(cè)序,篩選出292個(gè)新lnc RNAs。與T24細(xì)胞相比,T24/DOX(RI分別為6.12和13.01)中具有差異表達(dá)的lnc RNAs均有11個(gè),其中兩株耐藥細(xì)胞中共有表達(dá)的lnc RNAs有5個(gè),分別為MSTRG.14409(FC-1.5)、MSTRG.16907(FC0)、MSTRG.121(FC0)、MSTRG.17(FC0)、MSTRG.16359(FC1.5)。研究結(jié)論1.建立了穩(wěn)定的人膀胱癌多柔比星耐藥細(xì)胞株T24/DOX;2.T24/DOX的耐藥機(jī)制與抑制細(xì)胞凋亡、P-gp蛋白的表達(dá)升高有關(guān);3.高通量測(cè)序結(jié)果顯示,耐藥株T24/DOX與親本株T24存在異常表達(dá)的lnc RNAs。
【學(xué)位單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R737.14
【部分圖文】：

（Ａ）?Ｔ２４?（Ｂ）?Ｔ２４／ＤＯＸ??１．３．２?Ｔ２４／ＤＯＸ耐藥株的建立??Ｔ２４親本株對(duì)ＤＯＸ的ＩＣ５Ｑ為２４７．６ｎｇ／ｍｌ。經(jīng)過(guò)歷時(shí)１０個(gè)月的誘導(dǎo)，檢的ＤＯＸ對(duì)細(xì)胞的ＩＣ５Ｑ，觀察Ｔ２４／ＤＯＸ耐藥株耐藥指數(shù)的變化。Ｔ２４／ＤＯ逐漸變大，最終為３２２１?ｎｇ／ｍｌ，耐藥指數(shù)達(dá)到１３．０１，誘導(dǎo)后的Ｔ２４細(xì)胞感性顯著降低，呈現(xiàn)出明顯的耐藥性。??ｊ２４?Ｔ２４?２．５ｎｇ／ｍｌ?８ｈ（３）??〇〇－｜?？?�。�？？＊？＊？??Ｉｓ?Ｓ?１００＃??．?ｉｃ５０＝２４７．６ｎｅ／ｍ］?？?８〇—?ＩＣ５０＝３２２６〇－????Ｉ－?Ｘ???４０＇?＊?＇１?４０－?Ｓ?＼??，０－?￡?２０－??０?ｉ?■■?ｉ?■?ｉ?ｉ?〇ｌ?？?？?？?？?ｉ??１?１０?１００?１０００?１００００?１?１０?１００?１０００?１００００?１００Ｄｏｘ（ｎｇ／ｍｌ）?Ｄｏｘ（ｎｇ／ｍＩ）??

１．３．１?Ｔ２４親本株和Ｔ２４／ＤＯＸ耐藥株細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化??倒置顯微鏡觀察并記錄Ｔ２４親本株和Ｔ２４／ＤＯＸ耐藥株不同階段的細(xì)胞形態(tài)學(xué)??變化。在顯微鏡下，如圖１．１Ａ所示，Ｔ２４親本株細(xì)胞大小均一，形狀規(guī)則。加入??ＤＯＸ刺激，撤藥后約２４?ｈ后可觀察到細(xì)胞大量死亡，未發(fā)現(xiàn)形態(tài)上的明顯改變。??期間每?jī)商旄鼡Q一次新鮮培養(yǎng)基清除死細(xì)胞，剩余的極少數(shù)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，剩余的??細(xì)胞體積明顯增大，空泡增多，有的細(xì)胞出現(xiàn)突起如圖１．１Ｂ所示。隨著撤藥時(shí)間??延長(zhǎng)，存活的細(xì)胞開(kāi)始恢復(fù)生長(zhǎng)，但恢復(fù)后的細(xì)胞體積較大，出現(xiàn)腫脹變形，細(xì)胞??形態(tài)表現(xiàn)為大小不一，形狀不規(guī)則，喜聚團(tuán)生長(zhǎng)。??８??

?８??Ｔｉｍｅ?（ｄ）??圖２．１?Ｔ２４和Ｔ２４／ＤＯＸ的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線??２．３．２克隆形成實(shí)驗(yàn)??單細(xì)胞獨(dú)立生長(zhǎng)能力由克隆形成實(shí)驗(yàn)測(cè)定，當(dāng)單個(gè)細(xì)胞在體外持續(xù)分裂增殖６??次以上，其后代所組成的細(xì)胞群體，稱為克隆或者集落，通常情況下，每個(gè)克隆含??有５０個(gè)以上的細(xì)胞。通過(guò)計(jì)算克隆形成率，可以對(duì)細(xì)胞獨(dú)立生長(zhǎng)能力定量分析。??由圖２．２可見(jiàn)，與Ｔ２４親本株（１８．４±?１．８３）?％相比，Ｔ２４／ＤＯＸ耐藥株克隆形成率??（４４．９?±３．０３）?％明顯升高，克隆形成能力較強(qiáng)（蘆＜?０．０１）。由此可見(jiàn)Ｔ２４／ＤＯＸ耐??藥細(xì)胞株的增殖能力明顯強(qiáng)于Ｔ２４親本株細(xì)胞。??Ａ?Ｂ??Ｔ２４?Ｔ２４／ＤＯＸ??一?５０］??＿?？?Ｖ，４０．??＇／？？？、?１?＿藝??？?＇?＇?Ａ?／?＼?Ｉ?３０－?■！！??１?纏鬚繼藝??ｒ?？?？?坌?２０－?＿＿讓??ｉ?ｐｉｉｎ?ｍｍｍ??’？?．廣?Ｐ－?〇?ｈ?ｔ?１?ｆ麵ｙ?沴?ｊ??？?？?＊?＊?．?Ｆ２４?１２４／１）０?Ｘ??圖２．２Ｔ２４和Ｔ２４／ＤＯＸ克隆形成率（ｎ＝３），?“與Ｔ２４相比，尸＜
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