發(fā)布時間：2018-09-07 20:47

【摘要】：研究背景： 據報道世界范圍內約有15%-20%的育齡夫婦不能生育,且近半個世紀以來,由于環(huán)境、心理、社會等因素的影響,男性精子的數量和質量出現了明顯下降的趨勢,男女不育不孕的比例也由3：7上升到5：5,男性生殖健康正受到嚴重威脅。解脲支原體屬于條件致病微生物,可黏附在泌尿生殖道的黏膜及上皮細胞上,導致泌尿生殖道感染,并可從多方面影響男性生育能力,如通過干擾精子發(fā)生、影響精子代謝、影響精卵結合及生殖道局部免疫等機制,但其致男性不育的具體機制目前還不完全清楚。并有部分研究顯示解脲支原體對男性不育并無顯著的影響。由于各個實驗室的檢測試劑和方法的不同,不同地區(qū)男性不育患者精液中解脲支原體檢出率差異很大,可高達5%-58%,而正常生育者攜帶率為3%-31%。 解脲支原體對精液質量的影響同樣在以往的研究中未達到共識,臨床研究表明,解脲支原體感染患者存在精子數量降低,精子畸形率增加,液化時間延長及抗精子抗體陽性率上升等表現,而有些研究卻得到了陰性結果。導致上述分歧可能與受試個體的數目、區(qū)域、社會背景有關,解脲支原體不同生物群致病能力不同,也可能是原因之一。解脲支原體按照基因型不同,共分為2個生物群：biovar I和biovar II,研究顯示不同的生物群致病能力不同,biovar II可能與非淋菌性尿道炎、盆腔炎、宮頸炎、不良懷孕關系更加密切,解脲脲原體不同生物群與定植和感染的關系是目前該領域的研究熱點。 活性氧主要由白細胞和精子產生并釋放,生理狀態(tài)下,對維系精子的正常功能起到了重要的作用,然而精液中活性氧水平異常增加,破壞氧化還原系統(tǒng)平衡,會造成精子膜結構的氧化損傷,精子活動力下降,影響精子獲能和頂體反應的發(fā)生,并可攻擊精子核DNA,造成精子核DNA的損傷如染色體交聯、染色體缺失、堿基對修飾、單股和雙股DNA斷裂等,過多的活性氧還可誘導精子細胞凋亡,線粒體是介導細胞凋亡最重要的細胞器,高水平的活性氧可破壞線粒體膜,引起細胞色素c的釋放,激發(fā)半胱氨酸蛋白酶的級聯反應,觸發(fā)細胞凋亡。精液中活性氧的來源眾多,研究顯示感染可導致精液中活性氧的異常增加,然而迄今只有少數報道涉及某一特殊感染對精液中活性氧生成的影響。 研究目的： 1.調查研究解脲支原體及其生物群在不育和可生育人群中的感染率。 2.研究不同生物群解脲支原體感染對精子常規(guī)參數,精子運動參數,精子形態(tài)以及精液白細胞的影響；探討不同生物群解脲支原體感染與精液白細胞的關系及白細胞在解脲支原體感染影響精子參數中的作用。 3.進一步研究不同生物群解脲支原體感染對精液中活性氧產生,精子膜的脂質過氧化以及核DNA損傷的影響,并探討活性氧產生與精液白細胞的關系。 研究方法： 1.解脲支原體及其生物群在不育和可生育男性人群中的比例 對2012年7至2013年5就診于汕頭大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院的223例不育男性患者和146例可生育男性人群進行研究,研究對象的選取均嚴格按照本文的篩選標準,采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測解脲支原體在男性不育人群和可生育人群中的感染率,并撿出感染陽性患者,使用實時熒光定量PCR法鑒定其生物群。 2.不同生物群解脲支原體感染對精子常規(guī)參數,精子運動參數和精液白細胞的影響及白細胞在其中的作用 采用手淫法收取精液,液化后,檢測精子密度、活力、精子運動參數、白細胞、精子形態(tài)等參數,采用國產WLJY-9000型彩色精子自動分析系統(tǒng)分析,應用計算機精子形態(tài)分析軟件結合人工判讀進行分析,先后按照支原體感染種類和精液白細胞正常與否對所測標本的上述指標進行分組比較。 3.不同生物群解脲支原體感染對精液中活性氧產生,精子膜的脂質過氧化以及精子核DNA損傷的影響 以魯米諾為探針,運用化學發(fā)光法檢測精子活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)水平。分別采用硫代巴比妥酸法和黃嘌呤氧化酶法檢測精液中丙二醛(Malondial-dehyde, MDA)和總超氧化物歧化酶(Total Superoxide Dismutase, T-SOD)的濃度。采用精子染色質結構分析檢測精子核DNA完整性,采用單細胞凝膠電泳法檢測精子核DNA斷裂損傷 統(tǒng)計學處理 數據分析使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。率的比較使用卡方檢驗；多組間的比較使用ANOVA analysis, LSD用于組間比較；兩組數據的比較使用t檢驗,結果表示為均值士標準差。Levene's test被用作方差同源性檢驗,如方差不齊,使用Welch檢驗,組間比較采用Dunnett T3。P0.05被認為具有統(tǒng)計學意義。 研究結果： 1.解脲支原體及其生物群在不育和可生育男性人群中的比例 (1)解脲支原體在不育和可生育男性人群中的比例 對223例我院就診的不育男性和146例可生育人群精液中的解脲支原體感染率檢測,結果顯示雖然不育男性人群中的感染率為33.6%(75/223)較可育男性人群的感染率24.7%(36/146)有增高的趨勢,但兩者之間未具有統(tǒng)計學差異(χ2=3.379,P=0.066)。 (2)解脲支原體不同生物群在不育和可生育男性人群感染陽性標本中的檢出率 使用實時熒光定量PCR法檢測解脲支原體感染陽性標本兩種生物群的檢出率,結果顯示biovar II群在不育男性感染陽性標本中的檢出率42.7%(32/75)顯著高于可生育人群陽性標本中的檢出率22.2%(8/36),具有統(tǒng)計學差異(χ2=4.411,P=0.036)。 (3)解脲支原體不同感染類型在不育和可生育男性人群中的比例 在不育男性患者和可生育人群中分別有8例(10.7%)和3例(8.3%)被發(fā)現有混合感染(biovarⅠ和biovarⅡ同時存在),二者之間差異沒有統(tǒng)計學意義(χ2=0.148,P=0.700)。 2.不同生物群解脲支原體感染對精子常規(guī)參數,精子運動參數以及精液白細胞的影響及白細胞在其中的作用 (1)不同生物群解脲支原體感染對精子常規(guī)參數,精子運動參數以及精液白細胞的影響 按照感染類別將標本劃分為biovarⅠ, biovar Ⅱ,混合感染和未感染組共4組,比較分析了4組的精液常規(guī)參數和運動參數,結果顯示精子總活力在4組之間存在統(tǒng)計學差異(P=0.001)。其他參數諸如精子濃度,前向運動力雖然感染組較非感染組有降低的趨勢,但差異沒有統(tǒng)計學意義(P0.05)。組間比較結果顯示biovarⅡ感染組的精子濃度(59.25±49.21)以及biovarⅡ(54.95±16.21)和混合感染組(51.26×20.88)的總活力與未感染組(77.03±×43.97；66.29±×16.14)之間具有統(tǒng)計學差異(P=0.038；P0.001,P=0.005)。精子運動參數的分析結果顯示biovarⅡ感染組的曲線速度(Mean Curvilinear Velocity, VCL)(P0.001)、直線速度(Mean straight-line velocity, VSL)(P=0.002)、平均路徑速度(Mean Average Path, VAP)(P=0.024)、直線性(Mean Percentage Lineality, LIN)(P=0.009)、擺動性(Swing, WOB)(P=0.004)以及混合感染組的VCL(P=0.017)、 VSL(P=0.007)、LIN(P=0.016)與未感染組相比差異具有統(tǒng)計學意義；biovar Ⅰ感染組與未感染組相比各參數均無統(tǒng)計學差異(P0.05)。 同時我們發(fā)現biovar Ⅰ感染組71人中有12人精液白細胞增高,biovar Ⅱ感染組40人中有12人白細胞增高,混合感染組11人中有3人白細胞增高,未感染組258人中有25人白細胞增高。比較白細胞異常增加比率的結果顯示四組之間存在統(tǒng)計學差異(χ2=14.842,P==0.002)。組間結果比較顯示白細胞計數異常增加比例在biovar II感染組與未感染組之間具有統(tǒng)計學差異(χ2=13.136,P0.001),而biovar I感染組和混合感染組與未感染組之間差異沒有統(tǒng)計學意義(χ2=2.901,P=0.089；χ2=3.498,P=0.61),提示biovar II感染與精液中白細胞增加關系更加密切。 (2)精液白細胞異常增加對精子常規(guī)參數、運動參數以及精子形態(tài)的影響 白細胞異常組與白細胞正常組相比,精液常規(guī)參數中總活力、前向運動力和正常精子比率在兩組之間差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.008；P=0.005；P=-0.003)；精子運動參數中VCL (P=0.023)、VSL (P=0.010)、VAP (P=0.011)、WOB(P0.001)在兩組間具有統(tǒng)計學差異；精子形態(tài)異常率在兩組間具有統(tǒng)計學差異(P--0.008),其中頭部異常增加明顯(P=0.005)。以上結果提示白細胞異常增加可以導致精子質量和運動能力的下降以及畸形精子的比率增加。 3.不同生物群解脲支原體感染對精液活性氧產生,精子膜的脂質過氧化以及精子核DNA損傷的影響 (1)不同生物群解脲支原體感染對精液氧化還原系統(tǒng)及脂質過氧化的影響 我們按感染分類先后比較了4組間的精液ROS、MDA和T-SOD水平,結果顯示ROS水平在biovar II感染組(2.66±0.85)、混合感染組(2.82±±1.37)與未感染組(1.944±0.79)之間具有統(tǒng)計學差異(P0.001,P=0.003)；而biovar I感染組(2.20±±0.94)與未感染組之間差異沒有統(tǒng)計學意義(P=0.075)；MDA的檢測結果顯示biovar II感染組(1.25±0.61nmol/l)、混合感染組(1.30±0.61nmol/l)與未感染組(0.94±0.52nmol/l)之間具有統(tǒng)計學差異(P=0.004,P=0.040)；而biovar I感染組(1.05±±0.55)與未感染組之間差異沒有統(tǒng)計學意義(P=0.226)；T-SOD檢測結果顯示biovar I (63.57±8.95), biovar II感染組(62.71±7.10),混合感染組(61.81±±7.62)雖然低于未感染(64.49±±7.23)組,4組之間差異沒有統(tǒng)計學意義(P=0.556)。 (2)不同生物群解脲支原體感染對精子DNA氧化損傷的影響 使用精子染色質結構分析法對4組不同人群精子細胞染色質完整性進行分析比較,結果顯示biovar Ⅱ感染組的DNA碎片指數(DNA Fragmentation Index, DFI%)(22.59±7.59).高DNA可染性(High DNA Stainable, HDS%)(10.58±3.74)與未感染組(18.32±7.62；8.06±4.23)相比具有統(tǒng)計學差異(P=0.003；P=0.001)；混合感染組DFI%(23.44±4.89)與未感染組之間具有統(tǒng)計學差異(P=0.032),而HDS%(9.73±3.37)在兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P=0.181); biovar I感染組DFI%(20.03±7.21), HDS%(8.92±3.60)與未感染組之間差異均無統(tǒng)計學意義(P=0.155；P=0.175)。使用單細胞凝膠電泳檢測精子核DNA損傷,結果顯示biovar M感染組(1.06±0.15)與未感染組(0.94±0.12)之間彗星尾距(Tail Moment, TM)具有統(tǒng)計學差異(P0.001),而biovarⅠ感染組(0.96±0.11)和混合感染組(1.05±0.15)與未感染組之間差異沒有統(tǒng)計學意義(P=0.257,P=0.224)。 結論： 1.解脲支原體在不育男性人群中的感染率雖然較可生育男性人群高,但二者之間并不具有統(tǒng)計學差異,而解脲支原體陽性標本中biovarⅡ生物群的檢出率在兩組間具有統(tǒng)計學差異,提示biovarⅡ群感染可能與男性不育密切相關。 2.按感染類別分組進行的精子參數比較研究顯示只有總活力在4組之間存在統(tǒng)計學差異,組間比較發(fā)現biovarⅡ感染組的精子濃度及biovarⅡ和混合感染組的總活力與未感染組之間具有統(tǒng)計學差異。以上的結果提示biovarⅡ較biovarI對精子參數影響更加顯著,主要體現在精子活力方面,比較精子運動參數的結果提示biovarⅡ感染組的VSL、VCL、VAP、LIN、WOB與未感染組之間具有統(tǒng)計學差異。主要涉及以下機制①解脲支原體的強粘附作用②感染致精液中活性氧增加,破壞精子膜結構及引起線粒體膜電位的改變,影響精子的能量供應,降低精子活動力。同時,我們發(fā)現白細胞計數異常增加比例在biovarⅡ感染組與未感染組之間具有統(tǒng)計學差異。以往研究顯示白細胞是精液中活性氧的一個重要來源,結合上述結果,推測biovarⅡ群感染所致的精液白細胞異常增加并產生過多的活性氧可能是導致精子活力下降的主要原因之一。 3.為了證實白細胞增加對精液質量的影響,我們把精液標本分為白細胞正常組和白細胞異常組,分別比較了兩組的精子常規(guī)參數,運動參數以及精子形態(tài)。結果顯示精子常規(guī)參數中總活力、前向運動力和正常精子比率在兩組之間具有統(tǒng)計學差異。精子運動參數VCL、VSL、VAP、WOB白細胞異常組明顯低于白細胞正常組,白細胞異常組精子畸形率明顯增加,并以頭部畸形為主,提示精液中白細胞的異常增加可能導致精子質量的顯著下降。 4.進而我們研究比較了不同生物群解脲支原體對ROS產生的影響,結果顯示biovar II感染組和混合感染組的ROS水平與未感染組之間具有統(tǒng)計學差異。解脲支原體感染引起的活性氧增加主要有兩個來源,一方面,解脲支原體對精子最有毒害的代謝產物是H2O2和NH3。H2O2本身對精子是有害的,并且可以轉化成OH基自由基,而后者對細胞膜和DNA具有強毒性。除此之外脲原體磷脂酶A和C可以改變細胞膜的脂質結構,從而導致其完整性的損失并增加其滲透性。另一方面,解脲支原體(主要是biovar II群)感染可引起精液中白細胞異常增加,并產生過多的ROS。我們的結果提示biovar II群感染引起的精液白細胞異常增加可能是活性氧過量產生的最主要原因。MDA的檢測結果也驗證了此觀點,biovar II和混合感染組的MDA水平顯著增加,表明ROS所致的精子膜脂質過氧化增加,流動性下降,精子活動能力降低。然而此次研究中精液T-SOD水平未在感染組和未感染組之間發(fā)現有統(tǒng)計學差異。 5.精子DNA染色質結構分析實驗中的DFI%, HDS%以及單細胞凝膠電泳中的TM值在biovar II感染組與未感染組之間具有統(tǒng)計學差異,提示biovar II群感染可引起精液白細胞增加,釋放過量ROS,破壞精子DNA的完整性,導致DNA的斷裂損傷增加,最終影響男性的生育能力,并可能導致孕后的不良后果。 創(chuàng)新之處： 1.揭示了不同生物群解脲支原體在不育和可生育男性人群中的分布,biovarⅡ群在男性不育人群感染陽性標本中的檢出率顯著高于可生育人群。 2.比較研究了不同生物群解脲支原體對精子質量和精液白細胞的影響,提出biovarⅡ群對精液質量的影響更加明顯,尤其是精子總活力,同時biovarⅡ群感染可引起精液中白細胞的明顯增加。 3.從活性氧產生的角度,比較研究了不同生物群解脲支原體對ROS產生,精子膜脂質過氧化以及精子核DNA斷裂損傷的影響,提出biovarⅡ群可增加精液中ROS水平,引起精子膜脂質過氧化以及精子核DNA損傷,其機制可能與精液中白細胞增加有關。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R698.2

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 陸珍鳳,周曉軍,石群立,姜少軍,印洪林;電鏡顯示解脲支原體感染后在精子的部位[J];電子顯微學報;2005年04期

，

本文編號：2229374